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2013 年度 実績報告書

テンプレートによるタンパク質結晶の核形成の促進とマイクロ流体デバイスへの応用

研究課題

研究課題/領域番号 13J07016
研究機関九州大学

研究代表者

真栄城 正寿  九州大学, 大学院総合理工学研究院, 特別研究員(DC2

キーワードマクロ流体デバイス / タンパク質 / 結晶化
研究概要

本年度は、(1)試作型デバイスの作製や脂質二重膜の作製方法など、研究課題の基盤要素について検討を行った。また、(2)析出した結晶をダメージレスで評価するためのマイクロ流体デバイスの作製を行った。
(1)試作型デバイスは、PDMSとCOCシートからなるフィルムタイプのマイクロ流体デバイスを金蒸着カバーガラスに貼り合わせて作製した。脂質二重膜の作製においては、脂質の種類、脂質の混合比、ベシクル濃度、反応時間などについて検討を行った。AFMによって基板表面の測定を行ったところ、DOPC : DoGs-NTAの混合比が6:1の場合に最も適した割合でHisタグ付きタンパク質が基板表面に固定化されていることが明らかになった。
(2)ダメージレスなX線結晶構造解析の前処理(抗凍結処理)と100Kの温度下で測定が可能なデバイス開発を試みた。マイクロ流体デバイスにNomally Closed Valveを組み込むことによって、抗凍結処理を段階的に行うことが可能であった。また、100Kの窒素ガス気流内にデバイスを完浴させるために、デバイスのサイズを2~3mm角に再設計した。X線回折実験の結果、段階的に抗凍結処理を施した結晶から最も良好な回折データを取得できた。また、マイクロウェルの厚みを50μmとし、デバイス全体の厚みを240μmとした場合、デバイス、および溶媒からの散乱はほとんど観測されないことが分かった。さらに、3Å付近のアイスリングは観測されなかったため、結晶に直接触れること無く完全な回折データセットを取得可能なデバイス作製に成功した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

結晶化の足場と考えているHisタグ付きタンパク質の固定化は、固定化密度の制御が概ね可能となった。しかしながら、脂質の混合比に関してはさらなる検討の余地がある。また、ターゲットタンパク質の入手と調製は多少遅れている。一方でデバイス作製、測定においては、ダメージレスなX線結晶構造解析法を確立した。以上から、研究全体としてはおおむね順調に進展していると考えられる。

今後の研究の推進方策

今後も当初の計画に従って研究を推進する。テンプレートである脂質二重膜は、DOPC、DOGS-NTAにもう1種類の脂質を加えて、3種類の脂質を混合して作製する。そこに、Hisタグ付きタンパク質を固定化し、固定化密度などを評価する。また、最大の課題である結晶化に適したターゲットタンパク質は、早急に入手して結晶化可能な純度まで精製後、作製したテンプレートを用いて結晶化を試みる。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2014 2013

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (7件) (うち招待講演 2件)

  • [雑誌論文] Controlling Protein Crystal Nucleation by Droplet-based Microfluidics2014

    • 著者名/発表者名
      Masatoshi Maeki, Yuki Teshima, Saori Yoshizuka, Hiroshi Yamaguchi, Kenichi Yamashita, Masaya Miyazaki
    • 雑誌名

      A Chemistry European Journal

      巻: 20 ページ: 1049-1056

    • DOI

      10.1002/chem.201490013

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Controlling One Protein Crystal Growth by Droplet-based Microfluidics System2013

    • 著者名/発表者名
      Hiroshi Yamaguchi, Masatoshi Maeki, Kenichi Yamashita, Hiroyuki Nakamura, Masaya Miyazaki, Hideaki Maeda
    • 雑誌名

      The Journal of Biochemistry

      巻: 153 ページ: 339-346

    • DOI

      10.1093/jb/mvt001

    • 査読あり
  • [雑誌論文] マイクロ流体技術のタンパク質化学への応用2013

    • 著者名/発表者名
      真栄城 正寿
    • 雑誌名

      化学とマイクロ・ナノシステム研究会誌

      巻: 12 ページ: 19-22

    • 査読あり
  • [学会発表] On-chipでのタンパク質結晶の段階的抗凍結処理と回折強度への影響2013

    • 著者名/発表者名
      真栄城正寿、Ashtamurthy Pawate、山下健一、河本正秀、渡邉啓一、Paul J. A. Kenis、宮崎真佐也
    • 学会等名
      化学とマイクロ・ナノシステム学会 第28回研究会
    • 発表場所
      イーグレ姫路(兵庫県姫路市)
    • 年月日
      20131205-06
  • [学会発表] マイクロ流体デバイスとミクロシーディング法による好冷細菌Pseudoalteromonas sp. AS-131由来グルコキナーゼの結晶化の制御2013

    • 著者名/発表者名
      真栄城正寿、湧川盛洋、Ashtamurthy Pawate、河本正秀、山下健一、Paul J. A. Kenis、渡邊啓一、宮崎真佐也
    • 学会等名
      第86回 日本生化学会大会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • 年月日
      20130911-13
  • [学会発表] Crystallization of Glucokinase from Psychrophilic Pseudoalteromonas sp. AS-131 in Microfluidic Chip and Its Application for On-chip X-ray Diffraction2013

    • 著者名/発表者名
      Masaya Miyazaki, Masatoshi Maeki, Ashtamurthy S. Pawate, Morihiro Wakugawa, Kenichi Yamashita, Keiichi Watanabe, Paul J. A. Kenis
    • 学会等名
      RSC Tokyo International Conference 2013
    • 発表場所
      幕張メッセ(千葉県千葉市)
    • 年月日
      20130905-06
  • [学会発表] マイクロ空間を用いる晶析制御2013

    • 著者名/発表者名
      真栄城正寿
    • 学会等名
      マイクロ化学プロセス分科会 第4回討論・交流会
    • 発表場所
      産業技術総合研究所九州センター(佐賀県鳥栖市)
    • 年月日
      20130725-26
    • 招待講演
  • [学会発表] マイクロ流体デバイスを用いたタンパク質結晶のシーディング2013

    • 著者名/発表者名
      真栄城正寿、湧川盛洋、Ashtamurthy Pawate、山下健一、渡邉啓一、Paul J. A. Kenis、宮崎真佐也
    • 学会等名
      化学とマイクロ・ナノシステム学会 第27回研究会
    • 発表場所
      東北大学(宮城県仙台市)
    • 年月日
      20130523-24
  • [学会発表] マイクロ流体技術のタンパク質化学への応用2013

    • 著者名/発表者名
      真栄城正寿
    • 学会等名
      化学とマイクロ・ナノシステム学会 第27回研究会
    • 発表場所
      東北大学(宮城県仙台市)
    • 年月日
      20130523-24
    • 招待講演
  • [学会発表] マイクロ流体デバイスを用いた好冷細菌Pseudoalterommonas sp. AS-131由来グルコキナーゼ結晶のシーディング2013

    • 著者名/発表者名
      真栄城正寿、湧川盛洋、Ashtamurthy Pawate、山下健一、Paul J. A. Kenis、宮崎真佐也、渡邉啓一
    • 学会等名
      平成25年度日本生化学会九州支部例会
    • 発表場所
      佐賀大学(佐賀県佐賀市)
    • 年月日
      20130518-19

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公開日: 2015-07-15  

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