研究課題
・As-GEF-X結合タンパク質の取得これまでの解析から、長鎖ncRNA:As-GEF-XはGタンパク活性化ドメインを持つ機能未知分子GEF-Xの内在性アンチセンスRNAとして機能している可能性が考えられた。さらに、GEF-Xはc-Mycの下流で発現抑制を受けることから、癌抑制遺伝子である可能性が考えられていた。しかし、GEF-Xを強制発現させたHT29細胞をヌードマウスの皮下に移植し、造腫瘍性に与える影響を調べたところ、GEF-Xによる造腫瘍性の低下の程度がAs-GEF-Xのノックダウンに及ばないことから、As-GEF-XはGEF-Xを介さない経路でも造腫瘍性に寄与している可能性が考えら れた。As-GEF-XのGEF-Xを介さない機能を解明するために、As-GEF-Xの結合タンパク質取得を行った。ビオチン標識したAs-GEF-Xと細胞抽出液を混ぜ、ビオチン、アビジンの結合力を利用してAs-GEF-Xごと結合タンパク質をプルダウンした。さらに、精製したタンパク質が質量分析器により同定した。その結果As-GEF-X結合タンパク質としてProtein Xを同定することが出来た。・ As-GEF-Xの下流探索As-GEF-Xの細胞における機能を明らかにするために、As-GEF-Xを発現抑制したHT29細胞からRNAを抽出し、RNA-seqを行った。As-GEF-Xの減少に伴って発現低下する遺伝子群を抽出し、パスウェイ解析を行った結果、細胞周期の進行に関わる遺伝子群を見いだした。特にG1期の進行に関わる癌遺伝子の一つ、CDK6に関して顕著は発現の減少がみられた。さらに、ProteinXの発現抑制によってもCDK6の発現が減少することを見いだし、As-GEF-X、ProteinX、CDK6というカスケードがGEF-Xを介する経路とは独立に存在する可能性が示唆された。
1: 当初の計画以上に進展している
長鎖ncRNA:As-GEF-Xの結合タンパク質の網羅的探索を行い、ProteinXを同定した。ncRNAは何らかの結合タンパク質と複合体を形成して機能を発揮することが多いため、As-GEF-X結合タンパク質の取得は分子機能を突き詰めていく上で大きな手がかりを得られたといえる。
As-GEF-XがCDK6の発現を制御している分子メカニズムを明らかにしていく予定である。
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