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採用2年度目である平成26年度においては、研究課題遂行のために以下の項目に取り組んだ。
(1)蛍光プローブ分子を導入したHeLa細胞の観察とプローブの改良
前年度に続き、全反射照明蛍光(TIRF)顕微鏡とラインスキャン型ラマン顕微鏡のハイブリッドシステムの改善を行った。同時に、開発した装置を用いて、アポトーシス時にミトコンドリアから放出されるSmacというタンパク質にシアン蛍光タンパク質(CFP)をつなげた蛍光プローブを導入したHeLa細胞を観察した。蛍光像を観察しながらのラマンイメージ測定には成功したが、ラマン顕微鏡の励起光である532nmの光でCFPの蛍光が速やかに退色してしまうため、タイムラプス観察が困難であった。対策として、CFPの代わりに、ベンジルグアニン基を持つ蛍光色素を認識するSNAPタグをつなげたプローブを開発し、同じような測定を行ったものの、CFPと同様な蛍光退色が見られた。以上から、経時変化を観察するには別の励起波長の利用や異なる蛍光プローブを開発する必要があると結論した。
(2)細胞の化学固定が細胞内酸化還元状態に及ぼす影響の評価
経時変化観察が難しいという結果から、アポトーシス誘導からの各時間に対して多数の単一生細胞を測定することで、統計的に細胞内酸化還元状態の変化を追跡する方針を採った。そのために、細胞を化学固定した際に酸化還元状態が乱されるかどうかをまず調べた。測定には、新たに開発した405nm励起のラマン顕微鏡を利用した。パラホルムアルデヒドにより固定した細胞を測定した結果、固定操作を加えた細胞では酸化還元状態の平均値は変わらなかったものの、細胞毎の測定結果のばらつきが大きくなる傾向が示された。このため、固定細胞を利用してアポトーシスにおける酸化還元状態変化を追跡するには、大多数の細胞を測定する必要があることが分かった。
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