| 研究課題/領域番号 |
13J10124
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| 研究機関 | 徳島文理大学 |
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研究代表者 |
鈴木 雅代 徳島文理大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | グアニン酸化損傷 / G→C点突然変異 |
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| 研究実績の概要 |
これまでの研究からグアニン酸化損傷であるオキサゾロン(Oz)は様々なDNAポリメラーゼに共通して相補部位にグアニンが取り込まれることが明らかとなっており、G→C点突然変異を引き起こすグアニン酸化損傷であると考えられる。損傷塩基を含むDNAの複製を担うDNAポリメラーゼとしてPolη、Polι、Polκ、Polζ、REV1が知られているが、これらのDNAポリメラーゼはそれぞれ損傷乗り越え複製で得意とする損傷の種類が異なっている。それ故、これらのDNAポリメラーゼのOzに対する反応を解析し、Ozを含むDNAを効率良く複製できるDNAポリメラーゼを明らかにすることは、Ozから生じるG→C点突然変異の発生機構の解明において重要である。昨年度はREV1がOzに対してシトシンを取り込むこと、シトシンを取り込んだ後は伸長反応が停止することを明らかにした。本年度は、Ozに対する塩基取り込みおよび損傷乗り越え複製が解析されていないPolι、Polκについて、大腸菌発現系を用いてリコンビナントタンパクを作製し、これらの解析を行った。
作製したPolιとPolκを用いてOzに対する塩基の取り込み解析を行った結果、Polιは天然のGでは見られなかったグアニンとアデニンの取り込みが増加し、シトシンの取り込みが減少した。また、PolκはOzに対して主にグアニンとアデニンを取り込んだ。一方、Ozを含むDNAを用いて損傷乗り越え複製を解析した結果、PolιはOzに対して1塩基取り込んだ後は伸長反応が停止し、PolκはOzに塩基を挿入した後も複製を続けたがその効率は非常に悪いことを明らかにした。このことから、PolιとPolκはOzに関して誤りがちな複製を行うが、損傷乗り越え複製の停止または効率の悪さから、Ozの損傷乗り越えにおいては重要な役割は担っていないと考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
９の研究実績の概要に示したように、本研究では損傷乗り越え複製を担うDNAポリメラーゼのうちPolιとPolκのOzに対する塩基の取り込みおよび、損傷乗り越え反応を解析した。その結果、他のDNAポリメラーゼと同様にグアニンの取り込みが共通していることを明らかにした。また、PolιはOzに対して塩基を取り込んだ後は伸長が停止し、Polκの伸長効率は非常に低いことも明らかにした。しかし、Polιのリコンビナント作製ではHisタグを用いた場合はポリメラーゼ活性をもったPolιのリコンビナントが得られなかった。そこで、GSTタグに変更することで、ポリメラーゼ活性のあるPolιを得ることができた。このPolιのリコンビナント作製に時間を要したので、やや遅れている。本年度に解析できなかった、もう一つの損傷乗り越え複製のDNAポリメラーゼであるPolζについては現在解析中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの結果に加え本年度の研究により、損傷乗り越え複製を担うDNAポリメラーゼのうちPolζ以外に関しては、Ozに対して取り込む塩基および損傷乗り越え伸長反応が明らかとなった。しかし、PolιやPolκはREV1のようなOzに対する優位なシトシンの取り込みは見られなかった。また、もう一つの損傷乗り越え複製のDNAポリメラーゼであるPolζについては現在解析中である。
PolηやPolι、Polκ、PolζはREV1と相互作用することが知られているので、REV1がシトシンを取り込んだ後の伸長を担うDNAポリメラーゼである可能性を秘めている。今後は、REV1がOzに対してシトシンを取り込んだ後、これらのDNAポリメラーゼが伸長反応を効率良く行えるかどうかを解析する。
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