DNA修復酵素を用いた突然変異特異的クローニング法の確立

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14013052
• 研究機関: 北里大学
• 研究代表者: 塚本 俊彦 北里大学, 薬学部, 助教授 (10236862)
• キーワード: 大腸癌 / 突然変異

研究概要

1)Microsatellite Instability(MSI)陽性大腸癌の突然変異特異的クローニング法による解析
Microsatelite instability陽性大腸癌のうち、40%以上のmicrosatelliteでinstabilityのある病変(MSI-H)よりstrand-switch法を用いてcDNA libraryを作成する。隣接する正常組織より同様にcDNA libraryを作成した。これらをhybridizeさせ、A/Gミスマッチ特異的glycosylaseである大腸菌MutY、またはT/Gミスマッチ特異的glycosylaseであるhuman Thymine-DNA glycosylase(hTDG)を作用させ、さらにEDTA存在下でChitin binding domainをN末端に融合させたhuman AP endonuclase 1(hAPE1)を結合させ、Chitin beadsでpull-downした。Pull-downしたDNAをvectorにligationさせ大腸菌に導入しクローン化した。2次スクリーニングを行い、陽性cloneをsequenceし現在解析中である。
2)大腸癌肝臓転移転移病巣における突然変異特異的クローニング法による解析
転移特異的な、遺伝子の突然変異があるかどうかを、大腸癌の転移巣と原発巣を用い、上記1)の方法で現在解析中である。

研究成果

• [文献書誌] Furukawa, T., Konishi, F., Shitoh, K., Kojima, M., Nagai, H., Tsukamoto, T.: "Densely methylated MLH1 promoter correlates with decreased mRNA expression in sporadic colorectal cancers"Genes, Chromosomes & Cancer. 35. 1-10 (2002)
• [文献書誌] Furukawa, T., Konishi, F., Shitoh, K., Kojima, M.Nagai, H., Tsukamoto, T: "Evaluation of screening strategy for detecting hereditary nonpolyposis colorectal cancer"Cancer. 94. 911-920 (2002)