発がんに関わるゲノム刷り込み遺伝子の網羅的解析と制御機構解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14026029
• 研究機関: 鳥取大学
• 研究代表者: 押村 光雄 鳥取大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (20111619)
• 研究分担者: 加藤 基伸 鳥取大学, 大学院・医学系研究科, 寄附講座教員 (00273904) ; 久郷 裕之 鳥取大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (40225131)
• キーワード: がん / 刷り込み遺伝子 / LIT1 / IGF2 / RNA / FISH / クロマチン / MAR

研究概要

ヒト11p15.5領域のインプリントクラスター内に存在するnoncoding RNA LIT1が関わる発現制御機構および核マトリックスとゲノムDNAの特異的結合機構の解析を通してクロマチンドメインレベルにおける遺伝子発現制御機構を明らかにするために,1)Fluorescence in situ hybhdization(FISH)法による可視化させたLIT1 RNA分子の細胞内の発現動態の解析,2)活性クロマチンに認められるループ構造を維持するために機能的な構造体として細胞核内に存在する足場(核マトリックス)に結合する領域(Matrix Attachment Region, MAR)の機能解析を試みた。
1)LIT1 RNAはヒト正常リンパ球由来細胞株,ヒト正常線維芽細胞において各々96%,98%と高頻度に間期核内で検出され,LIT1 DNA近傍に局在していた。さらにFiber RNA-FISHにより,クロマチン上に集積するLIT1 RNAが観察された。一方,UBE3a遺伝子は65%,59%で間期核内にRNAシグナルが検出され,クロマチンファイバーに沿ったシグナルも認められなかった。これらのことより,LIT1,RNAは細胞周期を通して安定にLIT1 DNA周辺領域に局在し,noncoding RNAによるクロマチン構造の変化がドメインレベルの遺伝子発現制御に重要な役割を担っていることが示唆された。2)LIT1,IGF2刷り込み遺伝子のMAR候補領域をMAR予想解析ソフト(MAR-wiz software)を用いて検索した。その結果,各々遺伝子近傍領域を含めLIT1では2個,IGF2では,3個の候補領域を同定した。薬剤耐性遺伝子の両側におよそ5kbの相同領域を組み込んだターゲティングベクターを構築し,ヒト11番染色体を保持するDT40細胞内で相同組み換えによりMARを欠失させた候補クローンを単離し,PCRおよびサザンブロット解析を通してMARのターゲティングを確認した。さらに,改変したヒト染色体をチャイニーズハムスター細脚(CHO)株へ微小核細胞融合法を用いて導入し,現在単離した組胞クローンの解析中である。このように本年度において,MARの機能解析を行うための基盤は整った。

研究成果

• [文献書誌] Soejima, H., Nakagawachi, T., Wei Z., Urano, T., Matsuoka, S., Higashimoto, K., Kitajima, Y., Takeuchi, M., Nakayama, M., Oshimura.M..Miyazaki, K., Joh, K., Mukai T.: "Silencing of imprinted p57^<KIP2> gene expression is associated with loss of histone H3 lysine 9 methylation at DMR-LIT1 in esophageal cancer"Oncogene. (in press).
• [文献書誌] Maegawa, S., Itaba, N., Otsuka, S., Kamitani, H., Watanabe, T., Tahimic, CGT., Nanba, E., Oshimura.M.: "Coordinate downregulatiou of a novel imprinted transcript ITUP1 with PEG3 in glioma cell lines."DNA Resarch. (in press).
• [文献書誌] Higashimoto, K., Urano, T., Sugiura, K., Yatsuki, H., Joh, K.Zhao, W., Iwakawa, M., Ohashi, H., Oshimura.M., Niikawa, N., Mukai, T., Soejima.H.: "Loss of CpG methylation is strongly correlated with loss of histone H3 lysine 9 methylation at DMR-LIT1 in patients with Beckwith-Wiedemann syndrome."Am J Hum Genet. 73. 948-956 (2003)
• [文献書誌] Yuan, J., Luo, RZ., Fujii, S., Wang, L., Hu, W.Andreeff, M., Pan, Y.Kadota, M., Osimura.M., Sahin, AA., Issa, JP., Bast RC Jr., Yu, Y.: "Aberrant methylation and silencing of ARHI, an imprinted tumor suppressor gene in which the function is lost in breast cancers."Cancer Res. 63. 4174-4180 (2003)
• [文献書誌] Fujii, S., Luo, RZ., Yuan, J., Kadota, M., Oshimura, M., Dent, SR., Kondo, Y., Issa, JP., Bast, RC Jr., Yu, Y.: "Reactivation of the silenced and imprinted alleles of ARHI is associated with increased histone H3 acetylation and decreased histone H3 lysine 9 methylation."Hum Mol Genet. 12. 1791-1800 (2003)
• [文献書誌] Okita, C., Meguro, M., Hoshiya, H., Haruta, M., Sakamoto, YK., Oshimura.M.: "A new imprinted cluster on the human chromosome 7q21-q31, identified by human-mouse monochromosomal hybrids."Genomics. 81. 556-559 (2003)