神経系構築における硫酸化ヘキソサミン識別

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14082202
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 村松 喬 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (00030891)
• キーワード: N-アセチルグルコサミン / N-アセチルガラクトサミン / ミッドカイン / 硫酸化 / スルホトランスフェラーゼ / コンドロイチン硫酸 / プレイオトロフィン / ノックアウトマウス

研究概要

ミッドカインと50%のシークエンス同一性を持つプレイオトロフィン遺伝子を欠失するノックアウトマウスを作成した。既に作成したミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスと交配することにより、両遺伝子を欠失したダブルノックアウトマウスを作成した。ダブルノックアウトマウスは期待値の25%しか生せず、これらの遺伝子の発生への重大な関与が裏書きされた。さらにダブルノックアウトマウスは運動量が低下し、その原因を追及中である。N-アセチルグルコサミン6スルホトランスフェラーゼ1(GlcNAc6ST-1)遺伝子を欠失したノックアウトマウスも作成した。神経学的変化を調べるためのバッククロスを行っている。また、GlcNAc6ST-1をバキュロウィルスに発現させ、均一に精製した。この酵素を用いてGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcのN-アセチルグルコサミンの6位に硫酸基を導入した6-sulfo GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcを合成し、より高次の硫酸化オリゴ糖合成の基盤を作った。
神経系の構築に関与すると考えられる成長因子ミッドカインとコンドロイチン硫酸化E構造の識別について解析した。コンドロイチン硫酸Eはミッドカインによる神経細胞の突起伸長と移動を共に阻害する。市販のコンドロイチン硫酸Eにはグルクロン酸3硫酸構造など、いくつかの修飾が存在する。これらの効果について検討するため、コンドロイチン-4硫酸から出発してコンドロイチン硫酸Eを酵素的に合成した。この目的のためにコンドロイチン-4硫酸6-スルホトランスフェラーゼをバキュロウィルスに生産させて精製した。作成した人工コンドロイチン硫酸Eは強くミッドカインと結合し、ミッドカインとの強い結合にはE-ユニット(4,6-ジ硫酸化N-アセチルガラクトサミンを含むユニット)のクラスターの存在が必要、十分であることが判明した。また、種々のコンドロイチン硫酸をアクセプターとして人工コンドロイチン硫酸を作成し、イズロン酵の存在は必須でなく、6硫酸化が存在すると著しく結合性が低下することを見出した。

研究成果

• [文献書誌] Peng Zou: "Glycosaminoglycan structures required for strong binding to midkine, a heparin binding growth factor"Glycobiology. (in press).
• [文献書誌] Fathy M.El-Fasakhany: "N-Acetylglucosamine-6-sulfotransferase-1: production in thebaculovirus system and its applications to the synthesis of a sulfated oligosaccharide and to the modification of oligosaccharides in fibrinogen"Journal of Biochemistry. (in press).
• [文献書誌] Kenji Uchimura: "Specificities of N-acetylglucosamine-6-O-sulfotransferases in relation to L-selectin ligand synthesis and tumor-associated enzyme expression"The Journal of Biological Chemistry. 277. 3979-3984 (2002)
• [文献書誌] Akiko Kanamori: "Distinct sulfation requirements of selectins disclosed using cells that support rolling mediated by all three selectins under shear flow. L-selectin prefers carbohydrate 6-sulfation to tyrosine sulfation, whereas P-selectin does not"The Journal of Biological Chemistry. 277. 32578-32586 (2002)
• [文献書誌] Nahoko Sakaguchi: "Receptor-type protein tyrosine phosphatase ζ as a component of the signaling receptor complex for midkine-dependent survival of embryonic neurons"Neuroscience Research. 45. 219-224 (2003)
• [文献書誌] Takashi Muramatsu: "Midkine and pleiotrophin : two related proteins involved in development, survival, inflammation and tumorigenesis"Journal of Biochemistry. 132. 359-371 (2002)