| 研究課題/領域番号 |
14102031
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
甲斐 雅亮 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (00160953)
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| 研究分担者 |
椛島 力 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教授 (20274673)
太田 和子 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (20039647)
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| キーワード | 発光試薬 / 超高感度検出 / 核酸 / DNA解析 / 技術開発 / 化学発光 / 高分子化合物 / プローブ |
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| 研究概要 |
本研究の達成目標は、検体である核酸をポリメラーゼチェイン反応などによってコピー増幅することなく、さらに、現在の機器を改良することなく核酸の検出感度を飛躍的に高めるために、化学発光検出用の高分子プローブを創製し、それらを用いて、細胞内にあるゲノムDNAの異常配列又はmRNAの発現量の検査可能なDNA解析手法及び特定遺伝子の顕微検出法を開発することである。
本年度の研究では、デキストラン(平均分子量:2.0×106Da)にイソルミノール(IL)およびビオチン(Biot)を導入し、かつそれらの導入数の異なる6種類の水溶性の化学発光性高分子(IL)x-(Biot)y-(Glc)zを合成した。また、それらの発光性を調べた結果、分子内に結合しているILの数に比例して化学発光は強くなるのに対し、そのときの蛍光はILの数が多くなっても分子内消光によって徐々に減少する上昇率を示した。また、約3700個のILを導入した化学発光性高分子は、ナイロン膜上で約1fmolまでシグナルが確認でき、検量線は少なくとも1pmolまでの広範囲な比例関係を示した。さらに、70-350個のBiot導入数の異なる3種類の化学発光性高分子のアビジンに対する結合性を調べた結果、その1分子当たりのBiot結合数の増加とともに、アビジンに対する結合定数は上昇し、高分子1分子当たりに結合するアビジン数も増加することが分かった。
そこで、(IL)3700-(Biot)310-(Glc)12300を、マイクロアレイタイプの固相上で核酸を網羅的に検出できる高感度検出用プローブとして適応させるための基礎的諸条件を検討した。即ち固相上にスポットしたターゲットDNAに対して相補的なビオチン化cDNAをハイブリダイズさせたのち、予め化学発光性デキストランプローブをアビジンと複合体を形成させたものを、アビジンを介してビオチン化cDNAに結合させることによって、ターゲットDNAを化学発光で画像検出した。各種反応条件及び過剰の複合体を洗浄する条件などを検討した結果、ターゲットDNAの検出はサブピコモルレベルで達成された。それは、検討した濃度範囲(0.5pmol〜8.0pmol)において定量的なシグナルを与え、かつ良好な再現性も示した。以上の成果は、新規の化学発光性高分子プローブによって、固相膜上での簡便な遺伝子の高感度検出が可能であることを実証するものである。
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