| 研究課題/領域番号 |
14102031
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
甲斐 雅亮 長崎大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 教授 (00160953)
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| 研究分担者 |
椛島 力 長崎大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 助教授 (20274673)
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| キーワード | デキストランプローブ / 超高感度検出 / 核酸プローブ / DNA解析 / 技術開発 / 化学発光 / 高分子プローブ / 発光プローブ |
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| 研究概要 |
本研究の達成目標は、検体である核酸をポリメラーゼチェイン反応などによってコピー増幅することなく、さらに、現在の機器を改良することもなく核酸の検出感度を飛躍的に高めるために、化学発光検出用の高分子プローブを創製し、それらを用いて、ゲノムDNAの異常配列又はmRNAの発現量の検査可能な特定遺伝子の画像検出法を開発することである。そこで、研究代表者らは、水溶性の高分子に低分子量の発光物質を多数標識すると、低分子量の発光物質の結合数に応じて、蛍光はかなり消光するが、化学発光は著しく増大する現象を見出し、比較的高い発光量子収率を示す低分子量化学発光物質ルミノールおよびビオチンを水溶性の高分子に多数結合させた強発光性の高分子プローブをこれまでに創製した。
そこで、本年度の研究では、合成した高分子プローブを用いて、検体であるテロメアDNAの発現量を従来法よりも高感度に検査できる簡易なマイクロアレイDNAチップの画像検出手法を開発した。具体的には、ナイロン膜上にスポットしたターゲットDNAに対して相補的なビオチン化cDNAをハイブリダイズさせたのち、予め化学発光性プローブをアビジンとの連鎖複合体に形成させたものを、アビジンを介してビオチン化cDNAに結合させて、ターゲットDNAを化学発光で画像検出する手法である。各結合反応条件、ブロッキング条件並びに膜洗浄条件などを詳細に検討した結果、テロメアDNA(60mer)の検出下限が0.1pmolレベルである定量的な画像検出法を開発した。同一検体を用いて、同じくナイロン膜上で、ビオチン化cDNAと結合できるストレプトアビジン-HRPのエンハンサー含有ルミノールアッセイキット(世界最高レベルの高い検出感度を与える既存の検出法)と比較した結果、本研究で開発した手法が、より高感度であり、かつ非特異的な吸着に基づくバックグランドも低いものであった。
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