真核・原核生物の複合窒素呼吸系の分子機構解明

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14104005
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 祥雲 弘文 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (70012036)
• キーワード: 脱窒 / 複合呼吸 / 硝酸塩還元酵素 / ギ酸脱水素酵素 / ミトコンドリア / P450nor / NADH / 放線菌

研究概要

脱窒真菌Fusarium oxysporum脱窒系に関し、硝酸塩還元酵素とギ酸脱水素酵素のカップルの機能解明を行った。両者はキノンを介して連動し、カビ硝酸呼吸系のエネルギー生産における中心的な役割を果たしている。さらに、カビ脱窒系が誘導される微好気条件のミトコンドリアではシトクロムオキシダーゼも機能し、硝酸呼吸と酸素呼吸が併行して働く、複合呼吸(hybrid respiration)と呼ぶべき新たな呼吸形態が機能することを明らかにした。また脱窒系の誘導に関しP450nor遺伝子上流のプロモーター領域の解析を行い、硝酸塩感知および酸素抑制にかかわるシス因子をそれぞれ特定した。フラボヘモグロビン(Fhb)は還元酵素であるFADドメインとヘモグロビンドメインが融合し、一酸化窒素(NO)ジオキソゲナーゼとして働くユニークなタンパク質である。F.oxysporumのFhbを脱窒細菌に形質転換したところ脱窒機能の向上が見られ、Fhbが真菌および細菌脱窒系の機能発現に重要な関与をしていることが示唆された。カビ脱窒系にNO還元酵素として関わるP450norの反応中問体の物理化学的解明を行い、その化学的構造を明らかにした。さらにNADHアナログであるピリジンアルデヒドアデニンジヌクレオチドとP450norの複合体の結晶化およびX線構造解析に成功した。これらの成果により、P450norがNADHと複合体を形成し、2電子をヒドリドイオンとして直接受取る反応機構が強く支持された。
放線菌もカビと同様に好気的生物と思われていたが、我々は放線菌にも脱窒能を見出している。これまでカビと同様に、脱窒産物として亜酸化窒素(N_2O)を生成する放線菌しか見出されていなかったが、検索の結果、窒素ガス(N_2)を発生するStreptomyces antibioticusを見出した。そしてこのN_2が共脱窒による産物であること、このN_2とともに通常の脱窒産物としてのN_2Oを発生すること、などを明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Naoki Takaya, Hirofumi Shoun: "Genetic Engineering Using Fungal Flavohemoglobin for Constructing Pseudomonas stutzen Strain Emitting Less Nitrous Oxide"Joumal of Bioscience and Bioengineering. Vol.94 No.3. 282-284 (2002)
• [文献書誌] Hiromasa Uchimura, Hitoshi Enjoji, Takafumi Seki, Ayako Taguchi, Naoki Takaya, Hirofumi Shoun: "Nitrate Reductase-Formate Dehydrogenase Couple lnvolved in the Fungal Denitrification by Fusanum oxysporum"Journal of Biochemistry. Vol.131 No.4. 579-586 (2002)
• [文献書誌] Naoki Takaya, Hiromasa Utimura, Yupeng Lai, Hirofumi Shoun: "transcriptional Control of Nitric Oxide Reductase Gene(CYP55)in the Fungal Denitrifier Fusanum oxysporum"Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. Vol.66 No.5. 1039-1045 (2002)
• [文献書誌] Li Zhang, Takashi Kudo, Naoki Takaya, Hirofumi Shoun: "The B' Helix Determins Cytochrome P450nor Specificity for the Electron Donors NADH and NADPH"The Journal of Biological Chemistry. Vol.277 No.37. 33842-33847 (2002)
• [文献書誌] Yasuyuki Kumon, Yasuyuki Sasaki, Isao Kato, Naoki Tkaya, Hirofumi Shoun, Teruhiko Beppu: "Codenitrification and Denitrification Are Dual Metabolic Pathways through Which Dinitrigen Evolves from Nitrate in Streptomyces antibioticus"Journal of Bacteriology. Vol.184 No.11. 2963-2968 (2002)