生体細胞の凍結過程におけるミクロ熱・物質移動の能動的促進と活性評価法の確立

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14205033
• 研究機関: 日本大学
• 研究代表者: 棚澤 一郎 日本大学, 工学部, 教授 (30013105)
• 研究分担者: 白樫 了 東京大学, 生産技術研究所, 助教授 (80292754) ; 尾股 定夫 日本大学, 工学部, 教授 (90060186)
• キーワード: 医用生体工学 / 生体細胞凍結保存 / 凍害防御剤 / 活性評価法 / 能動的物質移動制御 / 軟らかさ計測 / 触覚センサシステム / 電場利用

研究概要

生体組織の凍結保存を成功させるには、凍結時に細胞の内外に生成する氷晶による致命的な損傷(凍害)を抑止する必要がある。そのため、凍結過程での冷却速度を制御すると同時に、凍害防御剤の適切な選定によって氷核の生成・成長を抑制することが行われている。凍結保存の一連の過程を通じて、細胞の生存を支配する現象には(1)浸透圧ストレス(細胞の過膨張・過収縮)、(2)細胞内凍結、(3)細胞外で生成した氷晶による力学的ストレス、(4)生化学的毒性、などがある。理想的な凍害防御剤とは、これらすべてをあらゆる冷却速度において回避できる能力をもつものと考えられる。
本研究の第一の目的[テーマ1]は、上記(1)〜(4)を回避できる凍害防御剤を選定し、さらに電場などを用いた能動的方法によって、凍害防御剤を速やかに細胞内に取り込み、上記(2)の抑止を実現することである。
第二の目的[テーマ2]は、凍結過程での生体細胞の活性評価法の確立である。本研究では、蛍光顕微鏡による光学的観察や超音波を用いた細胞の力学的特性計測など、実時間での活性評価法の確立をはかった。これら2テーマに関する本年度の研究成果の概要は次の通りである。
[テーマ1]:上に述べた条件を満足する候補物質として本年度は糖類を選択し、水溶液中での細胞内凍結率を測定した。その結果、多糖類であるトレハロースの凍結抑制効果が高いことを確認すると同時に、そのメカニズムについて古典的核生成理論に基づく考察を行った。
[テーマ2]:実際の生体細胞を用いた実験に先立って、アルギン酸と塩化カリウムを用いて疑似細胞を作り、凍害防御剤の効果および凍結時の氷晶の成長と、氷晶による(疑似)細胞での損傷発生過程の観察を行った。また、昨年度に引き続いて軟らかささ測定用触覚センサーシステムの改良を行い、直径1mmのガラス管の先端を直径数ミクロンから数十ミクロンに加工した接触子を試作し、アクチュエータで細胞表面をスキャンするマイクロバイオセンサシステムを開発した。このシステムによって、細胞の力学的特性を高分解能で簡便に測定し、その結果を3次元画像化することが可能になった。

研究成果

• [文献書誌] R.Shirakashi, K.J.Mueller, V.L.Sukhorukov, I.Tanasawa, U.Zimmermann: "Effects of Saccharide on Living Cells during the Freezing-Thawing Process and Effects of Their Uptake by Electroporation"Cryobiology. 47・47. 283-283 (2003)
• [文献書誌] R.Shirakashi, K.J.Mueller, V.L.Sukhorukov, U.Zimmermann: "Effects of Physiological Isotonic Cryoprotectants on Living Cells during the Freezing-Thawing Process and Effects of Their Uptake by Electroporation : Sp2 Cells in Alginate-Trehalose Solutions"Heat Transfer-Asian Research. 32・6. 511-523 (2003)
• [文献書誌] R.Shirakashi, V.L.Sukhorukov, I.Tanasawa, U.Zimmermann: "Measurement of he Permeability and Resealing Time Constant of the Electroporated Mammalian Cell Membrane"Int.J.Heat Mass Transfer. (発表予定). (2004)
• [文献書誌] S.Omata, Y.Murayama, C.E.Constantinou: "Development of a Novel Surgical Support Instrument and Virtual System Incorporating New Tactile Sensor Technology"Studies in Health Technology and Informatics. 98. 288-290 (2004)
• [文献書誌] Y.Murayama, C.E.Constantinou, S.Omata: "Micro Mechanical Sensing Platform for the Characterization of the Ovum via Uniaxial Measurement"Journal of Biomechanics. 37. 67-72 (2004)
• [文献書誌] Y.Murayama, S.Omata: "Fabrication of Micro Tactile Sensor for the Measurement of Micro Scale Local Elasticity"Sensors and Actuators A. 109. 202-207 (2004)
• [文献書誌] C.E.Constantinou, Y.Yoshimura, O.Yamaguchi, S.Omata: "Pilot Clinical Application of Directionally Sensitive Intra-vaginal Sensor Probe"Proceedings of Incontinence, The Engineering Challenge, I.Mech.E.. 1-16 (2003)