セルラーゼ複合体のナノ配向の解析と炭酸固定によるメタノール生成への応用

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14206038
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 大宮 邦雄 三重大学, 生物資源学部, 教授 (60023488)
• 研究分担者: 梶野 勉 豊田中央研究所, 生物部, 研究員 ; 木村 哲哉 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (00281080) ; 粟冠 和郎 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (20154031)
• キーワード: セルロソーム / セルラーゼ複合体 / Clostridium thermocellum / 炭酸ガス固定 / 人工酵素複合体 / 表面プラズモン共鳴

研究概要

1.遺伝子工学の手法を用いてClostridium Josui由来の骨格タンパク質に存在するコヘシンのうち2番目のものおよびClostridium thermocellumの細胞表層タンパク質SdbA由来のタイプ2コヘシンを連結したミニ骨格タンパク質Cip2を構築した。さらに、Cip2のC末端側にC.thermocellumの骨格タンパク質の4番目のコヘシンを連結したミニ骨格タンパク質Cip3を構築した。Cip2は大腸菌で、Cip3はカイコのシステムを利用して発現させた。
2.C.thermocellum由来の骨格タンパク質に存在するタイプ2ドックリンおよびC.josui Aga27Aのドックリンをそれぞれ大腸菌で発現させ、精製した。Cip2をビアコアのCM5チップに固定化し、精製したタイプ2ドックリンとAga27Aのドックリンをリガンドとして順に添加し、Cip2とリガンドの結合を観察した。その結果、タイプ2ドックリンが飽和するまでCip2に結合した後に、Aga27AのドックリンがCip2に結合することが観察された。リガンドを添加する順を逆にすると、すなわち、Aga27Aのドックリンの次にタイプ2ドックリンを添加すると、Aga27Aのドックリンが飽和するまで結合し、その後、タイプ2ドックリンが結合した。各ドックリンとコヘシンの結合のパラメータは、コヘシンを単独で発現させた時の値とほとんど同じであった。この結果は、特異性の異なるコヘシンを人為的に連結し、ミニ骨格タンパク質を構築した場合にも、元の結合特異性は保持されることを強く示唆する。
3.蟻酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をMycobacterium vaccaeから、また、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をGeobacillus stearothermocphilusからクローニングした。
4.蟻酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をC.josui Aga27Aのドックリンをコードする遺伝子と融合させ、発現ベクターpET-28aに連結し、大腸菌で発現させた。
5.キメラ酵素を精製し、ミニ骨格タンパク質Cip2との結合をビアコアを用いて測定した。その結果、ドックリンを蟻酸デヒドロゲナーゼとの融合タンパク質としても、結合特性に変化がないことが判明した。

研究成果

• [文献書誌] Jindou S, Souda A, Karita S, Kajino T, Beguin P, Wu D, Inagaki M, Kimura T, Sakka K, Ohmiya K.: "Cohesin/dockerin interactions within and between Clostridium josui and Clostridium thermocellum : Binding selectivity between cognate dockerin and cohesin domains and species specificity."J Biol Chem.. (In press). (2004)