EBウイルスをモデルとした真核細胞DNA複製の酵素学的解析

2004 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14208079
• 研究機関: (財)東京都医学研究機構
• 研究代表者: 正井 久雄 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (40229349)
• 研究分担者: 須賀田 直子 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (30344071) ; 高井 裕子 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (90332270) ; 森山 賢治 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (00250217) ; 釣本 敏樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (30163885) ; 白形 正樹 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (70251551)
• キーワード: Epstein Brrr Virus / in viitro DNA複製 / MCM複合体 / ORC複合体 / preRC / oriP / EBNAタンパク質 / 細胞周期

研究概要

潜伏感染期のEpstein-BarrウィルスのゲノムDNAはウィルス由来のタンパク質EBNA-1の存在下で1細胞周期あたり1回複製され、その複製開始や進行は宿主由来の因子(ORC, MCMなど)に依存していると考えられている。我々は、oriPプラスミドをモデルレプリコンとしてin vitroでのDNA複製反応系の構築を目指している。昨年度までに、細胞に導入したoriPの複製能獲得時期、複製したoriPの一部が核マトリクスに強固に結合していること、さらに、EBNA-1依存性複製は、Cdc7機能に依存することなどを見いだしている。本年度は、クロマチン上でのpreRC構築をin vitroで再現するために、ヒト培養細胞に一過的に導入した自律複製プラスミドを環状ミニ染色体として簡便に単離する方法を確立した。このために、1)培養細胞内でプラスミドを複製・増幅させるためにSV40の複製起点を導入し、トランスフェクション効率が高く増殖の盛んなSV40T抗原発現細胞を宿主とすること、および2)プラスミドにtet operator配列を複数導入し、その特異的吸着および回収のために組換え体tet repressorを固定化したアフィニティー担体を利用すること、という2つの改良を試みた。これにより、細胞抽出液からoriPプラスミド染色体を簡便且つ特異的に単離することが可能になった。現在、単離したクロマチン鋳型上において、精製したEBNA1,ORC, MCMタンパク質による複合体形成の解析をすすめている。さらに、preRC形成のために必要なタンパク質のなかで、MCMタンパク質はすでに、大量に精製して保持していたが、本年度はORC複合体を精製するために、その発現系の構築ならびに精製をこころみ、複合体を精製できる見通しがたった。

研究成果

• [雑誌論文] Cell cycle and developmental regulations of replication factors in mouse embryonic stem cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Fujii-Yamamoto, H., Kim, J-M., Arai, K., Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 12976-12987
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A second human Dbf4/ASK-related protein, Crf1/ASKL1 is required for efficient completion of S and M phases. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yoshizawa, N., Ishii, A., Taniyama, C., Matsui, E., Arai, K., Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 13062-13070
• [雑誌論文] Functional analyses of mouse ASK, an activator subunit for Cdc7 kinase, using conditional ASK knockout ES cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamashita, H., Kim, J-M., Koiwai, O., Arai, K., Masai, H.
  • 雑誌名: Genes to Cells (In press)
• [雑誌論文] Genetic dissection of mammalian Cdc7 kinase : Cell cycle and developmental roles. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kim, J-M., Masai, H.
  • 雑誌名: Cell Cycle 3 ページ: 300-304
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Functional interaction between tumor suppressor menin and activator of S-phase kinase. (2004)
  • 著者名/発表者名: Schnepp, R.W., Hou, Z., Wang, H., Petersen, C., Silva, A., Masai, H., Hua, X.
  • 雑誌名: Cancer Res. 64 ページ: 6791-6796
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Overexpression of CR/periphilin downregulates Cdc7 expression and induces S-phase arrest. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kurita, M., Suzuki, H., Masai, H., Mizumoto, K., Ogata, E., Nishimoto, I., Aiso, S., Matsuoka, M.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 32 ページ: 554-561
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より