| 研究概要 |
1.新規蛋白質間相互作用測定系split Fv(spFv)システムを用いたペプチドの非競合的免疫測定
骨代謝の診断マーカーとして重要なオステオカルシン(Bone Gla Protein, BGP)に対する抗体をモデルに,これまで報告例のない低分子ペプチドの非競合的免疫測定を試みた。この際,VH, VL間相互作用の測定が可能なファージ提示系であるspFvシステムを用い,BGP N/C末端を認識する6種類の抗体のオープンサンドイッチ法への適性を調べたところ,うち一種類につき顕著な抗原濃度依存的VH/VL相互作用変化が観察された。そこでVL断片をマルトース結合タンパク質MBPとの融合タンパク質として大腸菌で発現精製しマイクロプレートに固定化し,VH断片をアルカリフォスファターゼとの融合タンパク質として発現精製し,サンプルと共に当該プレートで反応させた。洗浄後の酵素活性を測定したところ,競合法より優れた感度と測定濃度域を,特別な条件検討なしに得ることができた。
2.オープンサンドイッチ法に適した抗体選択のための無細胞選択系の開発
ファージ提示系より原理的に大規模なライブラリを作製でき,高性能の抗体断片が選択できると期待される無細胞タンパク質合成・選択系の構築を試み,精製された必須因子のみからなる無細胞タンパク質合成系Pure Systemを用いて,抗ウシ血清アルブミン一本鎖抗体scFvの発現に成功した。また,この系の利点を生かし,タンパク質のfoldingを促進する各種分子シャペロニンの効果について定量的に検討し,この系ではトリガー因子およびDnaKが顕著にfoldingを促進することが示された。
3.真核細胞を用いた抗原特異的抗体発現細胞選択系の開発
抗原を認識して活性化し,増殖信号を伝達できる細胞表面キメラ受容体を発現させたIL-3依存性細胞株を用いて,抗原特異的な抗体断片を選択し,かつ細胞にCre recombinaseを発現させることで培養上清に糖鎖修飾scFvを分泌できるシステム(ASAPシステム)を構築した。
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