研究課題
基盤研究(B)
RNAサイレンシング(post-transcriptional gene silencing)は酵母からほ乳類まで広く存在する配列特異的RNA分解機構である。RNAサイレンシングの生物学的意義の一つが分子パラサイト(ウイルス、トランスポゾン、トランスジーン)に対する防御反応との見方が提起されている。一方、ウイルスもその賢知を示すかのように宿主防御と考えられるRNAサイレンシングに対抗するための抑制蛋白質をコードする事が植物ウイルス、動物ウイルスで証明されている。これまでのところ、抑制蛋白質は1本鎖RNAウイルス、1本鎖および2本鎖DNAウイルスで報告されているが、2本鎖RNAウイルスでの報告例はない。本課題は子のう菌であるクリ胴枯病菌PTGS発動株を用いて、クリ胴枯病菌感染性ハイポウイルスの他、植物、動物ウイルス由来のPTGS打破作用を有する蛋白質を同定し、性格付けを行なうことを目的としている。これまでに以下の成果を得た。1)抑制蛋白質候補遺伝子を発現しているクリ胴枯病菌に異種ウイルスであるマイコレオウイルス1(MYRV1)を感染させ、その増殖量が高まるかどうかでPTGSサプレッサー活性を持つかどうかを検定した。その結果、ハイポウイルス由来パパイン様プロテアーゼp29を発現しているクリ胴枯病菌では、異種ウイルスであるMYRV1の増殖量が高まったのに対し、ハイポウイルスの複製を高めるp40の発現体ではMYRV1の増殖量変化がなかった。この検定法を用いて、植物ウイルスであると同時に昆虫ウイルスでもある植物レオウイルス(イネ萎縮ウイルス,RDV ; wound tumor virus, WTV)のゲノムセグメント12本の分節2本鎖RNAセグメントにコードされた蛋白質の検定を行った。その結果、MYRV1の複製を高める蛋白質は検出されなかった。2)ハイグロマイシン耐性遺伝子(HygR)を標的とするPTGSクリ胴枯病菌株の作出を試みた。既に恒常発現用GPDプロモーター支配下に連結したHygRで形質転換した株を得た。PTGS引き金として働くdsRNAを菌細胞内で合成させるため、完全長逆反復配列Hyg(イントロンを含む)でハイグロマイシン耐性株を二重形質転換を行った。二重形質転換体がPTGSを示すかどうかをハイグロマイシンに対して感受性になるかどうかで調べた。数百系統の形質転換体の内、十数株が感受性を示した。DNA解析を行った結果、二重形質転換体が逆反復配列を保持していることが示された。従って、Hyg感受性株はRNAサイレンシングによって感受性を示すことが示唆された。現在、これらの系統を用いて上記のウイルス蛋白質のRNAサイレンシング抑制活性を解析中である。
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