触媒アミノ酸の変異により新しい機能を獲得したグリコシラーゼの研究

2004 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 14360043
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用微生物学・応用生物化学
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 木村 淳夫 北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (90186312)
• 研究分担者: 森 春英 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (80241363) ; 奥山 正幸 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助手 (00344490)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2004
• キーワード: 糖転移 / グリコシダーゼ / 合成酵素

研究概要

グリコシラーゼは糖質のグリコシド結合を加水分解する酵素の総称である。これらの酵素は加水分解の他に、基質のグリコシド残基をアクセプターに転移する反応(糖転移反応)を示す。転移反応は応用性が高く、i)清涼飲料水などの食品に含まれる機能性オリゴ糖の生産やii)多彩な生理活性をもつ複合糖鎖の合成に利用されている。しかし、加水分解と糖転移反応は切り離すことはできず、同時に進行する。従って、転移糖の生成条件であっても基質の加水分解が行われ、かつ、転移反応の生成物も分解されてしまう。我々は、グリコシラーゼの構造と機能を解析してきた。この研究過程で糖転移反応のみを抽出できる現象を見出した。本課題の目的は、本現象の機構を分子解析し応用に結びつけることであり、成果を以下に示す。1)対象としたグリコシラーゼについて自殺基質の手法で求核残基を推定後、本残基の点置換酵素(合成酵素)を発現・精製した。フルオライド基質について合成法を確立させ、大量調製を行った。得られた合成酵素は、いずれも分解活性を示さず、フルオライド基質とアクセプター基質を合成させる反応のみを行った。合成の至適pHはアルカリ側へシフトし、本現象は一般的に観察された。アクセプター特異性を調べたところ、アリールなどの疎水基を有する合成配糖体が最も高い収率を与えた。これは、サブサイト+2による疎水グループへの認識能が高いことを意味している。2)「歪み発生のアミノ酸変異酵素」を作製・精製・性質解析を行い、オリゴ糖合成試験を行った。収率が低いことが判明したので、反応条件を検討し、基質濃度の変化に効果を認めた。また、有機溶媒の添加も有効であったが、高濃度では活性低下が生じた。有機溶媒に耐性な糖質分解酵素が得られているので、これを歪み発生型酵素にするような発展研究を行いたい。

研究成果

• [雑誌論文] Enzymatic synthesis of α-2-glucosides by alcohols resistant α-glucosidase from Aspergillus niger (2005)
  • 著者名/発表者名: Y.-M.Kim
  • 雑誌名: Tetrahedron : Asymmetry 16 ページ: 403-409
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Aglycon specificity profiling of α-glucosidases using synthetic probes (2005)
  • 著者名/発表者名: W.Hakamata
  • 雑誌名: Bioorg.Med.Chem.Lett. 60(in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Involvement of individual subsites and secondary substrate binding sites in multiple attack on amylose by barley α-amylase (2005)
  • 著者名/発表者名: B.Kramhoft
  • 雑誌名: Biochemistry 40・6 ページ: 1824-1832
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Molecular analysis of α-glucosidase belonging to GH-family 31 (2005)
  • 著者名/発表者名: H.Nakai
  • 雑誌名: Biologia 60(in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Cloning and expression of levansucrase from Leuconostoc mesenteroides B-512FMC in Escherichia coli. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kang FK, Seo MY, Seo ES, Kim D, Chung SY, Kimura A, Day DF, Robyt JF
  • 雑誌名: Biochim Biophys Acta 1727(1) ページ: 5-15
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Enzymatic synthesis of α-2 glucosides by alcohols resistant α-glucosidase from Aspergillus niger. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kim YM, Okuyama M, Mori H, Nakai H, Saburi W, Chiba S, Kimura A
  • 雑誌名: Tetrahedron : Asymmetry 16 ページ: 403-409
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Involvement of individual subsites and secondary substrate binding sites in multiple attack on amylose by barley α-amylase. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kramhoft B, Bak-Jensen KS, Mori H, Juge N, Nohr J, Svensson B
  • 雑誌名: Biochemistry 44(6) ページ: 1824-1832
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Aglycon specificity profiting of α-glucosidases using synthetic probes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Hakamata W, Muroi M, Kadokuta K, Nishio T, Oku T, Kimura A, Chiba S, Takatsuki A
  • 雑誌名: Bioorg Med Chem Lett. 15(5) ページ: 1489-1492
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Molecular analysis of a-glucosidase belonging to GH-family 31. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakai H, Okuyama M, Kim YM, Saburi W, Wongchawalit J, Mori H, Chiba S, Kimura A
  • 雑誌名: Biologia 60 (11)(in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Two potent competitive inhibitors discriminating α-glucosidase family I from family II (2004)
  • 著者名/発表者名: A.Kimura
  • 雑誌名: Carbohydr.Res. 339・6 ページ: 1035-1040
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Indentitication of amino acids residues for key role in dextransucrase activity of Leuconostoc mesenteroides B-742CB (2004)
  • 著者名/発表者名: H.-J.Ryu
  • 雑誌名: J.Microbiol.Biotechnol. 14・5 ページ: 1075-1080
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] オオムギα-アミラーゼの基質認識のメカニズムを探る (2004)
  • 著者名/発表者名: 森 春英
  • 雑誌名: 化学と生物 42・3 ページ: 170-177
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Purification and Characterization of Acremonium implicatum α-Glucosidase Having High Regioselectivety for α-1,3-Glucosidic Linkage (2004)
  • 著者名/発表者名: T.Yamamoto
  • 雑誌名: Biochim.Biophys.Acta 1700・2 ページ: 189-198
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Overexpression and characterization of two unknown proteins, YicI and YihQ, originated from Escherichia coli (2004)
  • 著者名/発表者名: Okuyama M
  • 雑誌名: Pro.Expres.Purif. 37 ページ: 170-179
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Localization of α-glucosidases I, II, and III in organs of Europian honeybee, Apis mellifera L., and origin of α-glucosidase in honey (2004)
  • 著者名/発表者名: M.Kubota
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 68・11 ページ: 2346-2352
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Cloning and expression of levansucrase from Leuconostoc mesenteroides B-512FMC in Escherichia coli (2004)
  • 著者名/発表者名: F.K.Kang
  • 雑誌名: Biochim.Biophys.Acta 1727・1 ページ: 5-15
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Isolation and characterization of cDNA encoding P-19.5 protein accumulated preferentially at early stage of carrot somatic embryogenesis (2004)
  • 著者名/発表者名: T.Sano
  • 雑誌名: Plant Sci. 167 ページ: 1211-1217
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Two potent competitive inhibitors discriminating α-glucosidase family I from family II. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kimura A, Lee JH, Lee IS, Park KH, Chiba S, Kim D
  • 雑誌名: Carbohydr Res 339(6) ページ: 1035-1040
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Molecular mechanism of substrate recognition of barely α-amylase. (2004)
  • 著者名/発表者名: Mori H
  • 雑誌名: Kagaku to Seibutu 42(3) ページ: 170-177
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Indentifrcation of ammino acids residues for key role in dextransucrase activity of Leuconostoc mesenteroides B-742CB. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ryu HJ, Kim D, Seo ES, Kang HK, Lee JH, Yoon SH, Cho JY, Robyt IF, Kim DW, Chang SS, Kim SU, Kimura A
  • 雑誌名: J Microbiol Biotechnol 14(5) ページ: 1075-1080
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Purification and characterization of Acremonium implicatum α-glucosidase having high regioselectivety for α-1,3-glucosidic linkage. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto T, Unno T, Watanabe Y, Yamamoto M, Okuyama M, Mori H, Chiba S, Kimura A
  • 雑誌名: Biochim Biophys Acta 1700(2) ページ: 189-198
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Overexpression and characterization of two unknown proteins, YicI and YihQ, originated from Escherichia coli. (2004)
  • 著者名/発表者名: Okuyama M, Mori H, Chiba S, Kimura A
  • 雑誌名: Pro Expres Purif 37 ページ: 170-179
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Localization of α-glucosidases I, II and III in organs of European honeybee, Apis mellifera L., and origin of α-glucosidase in honey. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kubota M, Tsuji M, Nishimoto M, Wongchawalit J, Okuyama M, Mori H, Masui H, Surarit R, Svasti J, Kimura A, Chiba S
  • 雑誌名: Biosci Biotechnol Biochem 68(11) ページ: 2346-2352
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Isolation and characterization of cDNA encoding P-19.5 protein accumulated preferentially at early stage of carrot somatic embryogenesis. (2004)
  • 著者名/発表者名: Sano T, Nishiznoto M, Saburi W, Kimura A, Yasuda H, Uchibatake M, Ohwada T, Masuda H
  • 雑誌名: Plant Sci 167 ページ: 1211-1217
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Evidence of Intramolecular Transglucosylation Catalyzed by an α-Glucosidase (2003)
  • 著者名/発表者名: M.Son
  • 雑誌名: J.Appl.Glycosci. 50・1 ページ: 41-44
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Characterization, and Sequence Analysis of Two α-Amylase Isoforms from Azuki Bean, Vigna angularis, Showing Different Affinity towards β-Cyclodextrin (2003)
  • 著者名/発表者名: S.S.Mar
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 67・5 ページ: 1080-1093
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Purification, Characterization and Molecular Cloning of Tyrosinase from the Cephalopod mollusc, Illex argentiinus (2003)
  • 著者名/発表者名: T.Naraoka
  • 雑誌名: Eur.J.Biochem. 270・19 ページ: 4026-4038
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Impact on substrate specificity of mutational subsite isozyme mimicry in barley α-amylase (2003)
  • 著者名/発表者名: B.Svensson
  • 雑誌名: J.Appl.Glycosci. 50・2 ページ: 143-145
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Barley proteome analysis, starch degrading enzymes and proteinaceous inhibitors (2003)
  • 著者名/発表者名: C.Finnie
  • 雑誌名: J.Appl.Glycosci. 50・2 ページ: 277-282
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] α-Glucosidase変異酵素がα-Glycosynthase反応を触媒する (2003)
  • 著者名/発表者名: 奥山正幸
  • 雑誌名: 農化 77・11 ページ: 1140-1141
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] α-glucosidase変異酵素がα-Glycosynthase反応を触媒する (2003)
  • 著者名/発表者名: 奥山正幸
  • 雑誌名: 化学と生物 41・7 ページ: 422-425
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Inhibitory effect of salicylhydroxamic acid on theobroxide-induced potato tuber formation (2003)
  • 著者名/発表者名: X.Gao
  • 雑誌名: Plant Sci. 165・5 ページ: 993-999
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Evidence of intmrnolecular transglucosylation catalyzed by an α-glucosidase. (2003)
  • 著者名/発表者名: Son M, Mori H, Okuyama M, Kimura A, Chiba S
  • 雑誌名: J Appl Glycosci 50(1) ページ: 41-44
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Purification, characterization, and sequence analysis of two α-amylase isoforms from azuki bean, Vigna angularis, showing different affinity towards β-cyclodextrin. (2003)
  • 著者名/発表者名: Mar SS, Mori H, Fukuhara A, Okuyama M, Saburi W, Fukuda K, Lee JH, Chiba S, Kimura A
  • 雑誌名: Biosci Biotechnol Biochem 67(5) ページ: 1080-1093
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Impact on substrate specificity of mutational subsite isozyme mimicry in barley α-amylase. (2003)
  • 著者名/発表者名: Svensson B, Mori H, Bak-Jensen KS, Jensen MT
  • 雑誌名: J Appl Glycosci 50(2) ページ: 143-145
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Barley Proteome analysis, starch degrading enzymes and proteinaceous inhibitors. (2003)
  • 著者名/発表者名: Finnie C, Oestergaad O, Bak-Jensen KS, Nielsen PK, Bonsager BC, Mori H, Nohr J Kramhoft B, Juge N, Svensson B
  • 雑誌名: J Appl Glycosci 50(2) ページ: 277-282
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] α-Glucosidase mutant catalyzes α-glucosynthase-type reaction. (2003)
  • 著者名/発表者名: Okuyama M, Mori H, Watanabe K, Kimura A, Chiba S
  • 雑誌名: J Soc Biosci Biotech Agrochem 77(11) ページ: 1140-1141
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Purification, characterization and molecular cloning of tyrosinase from the cephalopod mollusc, Illex argentiinus. (2003)
  • 著者名/発表者名: Naraoka T, Uchisawa H, Mori H, Matsue H, Chiba S, Kimura A
  • 雑誌名: Eur J Biochem 270(19) ページ: 4026-4038
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Glycosidase losing hydrolytic reaction catalyzes oligosaccharide-synthesis. (2003)
  • 著者名/発表者名: Okuyama M
  • 雑誌名: Kagaku to Seibutu 41(7) ページ: 422-425
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Inhibitory effect of salicylhydroxamic acid on theobroxide-induced potato tuber formation. (2003)
  • 著者名/発表者名: Gao X, Yang Q, Minami C, Matsuura H, Kimura A Yoshihara T
  • 雑誌名: Plant Sci 165(5) ページ: 993-999
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Identification of Essential Ionizable Groups and Evaluation of Subsite Affinities in the Active Site of β-D-Glucosidase F1 from Streptomyces sp. (2002)
  • 著者名/発表者名: K.Fukuda
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 66・10 ページ: 2060-2067
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Kinetic Studies on Substrate Specificity and Active Site of β-D-Glucosidase F1 from Streptomyces sp. (2002)
  • 著者名/発表者名: K.Fukuda
  • 雑誌名: J.Appl.Glycosci. 49・3 ページ: 265-272
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Barley α-Amylase Met53 Situated at the High-affinity Subsite -2 Belongs to a Substrate Binding Motif in the α→β Loop 2 of the Catalytic (β/α)_8-Barrel and Is Critical for Activity and Substrate Specificity (2002)
  • 著者名/発表者名: H.Mori
  • 雑誌名: Eur.J.Biochem. 269・22 ページ: 5377-5390
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Fascinating Facets of Function and Structure of Amylolytic Enzymes of Glycoside Hydrolase Family 13 (2002)
  • 著者名/発表者名: B.Svensson
  • 雑誌名: Biologia 57・Suppl 11 ページ: 5-19
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Kinetic studies on substrate specificity and active site of β-D-glucosidase F1 from Streptomyces sp. (2002)
  • 著者名/発表者名: Fukuda K, Shirakawa K, Mori H, Okuyama M, Kimura A, Ozaki H, Yoneyama M, Chiba S
  • 雑誌名: J Appl Glycosci 49(3) ページ: 265-272
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Identification of essential ionizable groups and evaluation of subsite affinities in the active site of β-D-glucosidase Fl from Streptomyces sp. (2002)
  • 著者名/発表者名: Fukuda K, Mori H, Okuyama M, Kimura A, Ozaki H, Yoneyama M, Chiba S
  • 雑誌名: Biosci Biotechnol Biochem 66(10) ページ: 2060-2067
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Barley α-amylase Met53 situated at the high-affinity subsite-2 belongs to a substrate binding motif in the α→β Loop 2 of the catalytic (β/α)8-barrel and is critical for activity and substrate specificity. (2002)
  • 著者名/発表者名: Mori H, Bark-Jensen KS, Svensson B
  • 雑誌名: Eur J Biochem 269(22) ページ: 5377-5390
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Fascinating facets of function and structure of amylolytic enzymes of glycoside hydrolase family 13. (2002)
  • 著者名/発表者名: Svensson B, Jensen MT, Mori H, Bark-Jensen KS, Bonsager B, Nielsen PK, Kramhoft B, Praetorius-Ibba M, Nohr J, Juge N, Greffe L, Williamson G, Driguez H
  • 雑誌名: Biologia 57(Suppl 11) ページ: 5-19
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [図書] α-グルコシダーゼ(廣川タンパク質化学第4巻酵素4.3ヒドロラーゼ[II]) (2004)
  • 著者名/発表者名: 木村淳夫
  • 総ページ数: 11
  • 出版者: 廣川書店
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] β-グルコシダーゼ(廣川タンパク質化学第4巻酵素4.3ヒドロラーゼ[II]) (2004)
  • 著者名/発表者名: 福田健二
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 廣川書店
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] 6-ホスホβ-グルコシダーゼ(廣川タンパク質化学第4巻酵素4.3ヒドロラーゼ[II]) (2004)
  • 著者名/発表者名: 木村淳夫
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 廣川書店
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] Structure and function of α-glucosidase in grains (Recent Advances in Enzymes in Grain Processing) (2003)
  • 著者名/発表者名: S.Chiba
  • 総ページ数: 6
  • 出版者: ACCO (Leuven, Belgium)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [産業財産権] アノマー保持型糖加水分解酵素変異体及びその製造方法 (2004)
  • 発明者名: 佐分利 亘
  • 権利者名: 小川 浩一
  • 産業財産権番号: 特許公開2004-61180
  • 出願年月日: 2004-03-04
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より