非プロテアーゼ系炭素-窒素結合切断酵素群の分子機能解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14360047
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 小林 達彦 筑波大学, 応用生物化学系, 教授 (70221976)
• 研究分担者: 合田 昌彦 日本学術振興会, 応用生物化学系, 特別研究員(PD) ; 東端 啓貴 筑波大学, 応用生物化学系, 助手 (20344864) ; 橋本 義輝 筑波大学, 応用生物化学系, 助手 (00323254)
• キーワード: ニトリラーゼ / ニトリルヒドラターゼ / アミダーゼ / ニトリル / アミド / イソニトリルヒドラーゼ / イソニトリル / アルドキシムデヒドラターゼ

研究概要

非プロテアーゼ系炭素-窒素結合切断酵素群の中で、(他の酵素に関しては継続して研究を進めているが)現在、特にアルドキシムデヒドラターゼに関して得られている成果について以下に記載する。
Pseudomonas chlororaphis B23のニトリルヒドラターゼ遺伝子クラスター上流に発見したORFは、アルドキシムデヒドラターゼに相同性を示した。ORF産物を大腸菌で発現させた結果、ブチルアルドキシムを基質としてニトリルを生成する酵素活性が現われたことから、本ORFをアルドキシムデヒドラターゼ遺伝子と同定した。次に、本酵素を単一に精製し、様々な解析を行った。精製酵素はヘムタンパク質に特徴的なスペクトルパターンを示し、ピリジンヘモクロム法によるヘムの同定と定量を行った結果、本酵素はプロトヘムIXを補欠分子族として含むことが明らかとなった。嫌気条件下において、還元剤であるジチオナイトを加えた結果、酵素活性が飛躍的に上昇した。一方、酸化剤であるフェリシアナイドを加えた場合、活性が完全に消失した。このことから、精製酵素のヘムは大部分酸化されているが、還元型ヘムを持った状態が本酵素の本来の活性型であると推測した。その他、本酵素の詳細な酵素化学的諸性質を明らかにした。さらに、本酵素がB23株で実際に機能していることを証明するため、精製酵素を用いて抗体を作成し、ウエスタンブロッティングによる検出を試みた。'スクロース、硫酸アンモニウムをそれぞれ単一C源、単一N源として培養すると、無細胞抽出液中に本酵素活性は認められず、抗体で検出することもできなかった。一方、ブチルアルドキシムを単一C源、単一N源として生育すると、本酵素活性が現れ、SDS-PAGE上で精製酵素と同じ位置に抗体と強く結合するバンドが出現した。従って、本酵素はアルドキシム存在下で誘導され、その代謝に実際に機能していることが実証された。

研究成果

• [文献書誌] Oinuma, K-I. et al.: "Novel aldoxime dehydratase involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis of pseudomonas chlororaphis B23 : Sequencing, gene expression purification and characterization"J.Biol.Chem.. 278. 29600-29608 (2003)
• [文献書誌] Kojima, Y. et al.: "A novel lipase from pseudomonas fluorescens HU380 : Gene cloning overproduction, renaturation-activation, two-step purification and characterization"J.Biosci.Bioeng.. 96. 242-249 (2003)
• [文献書誌] Shiraki, K. et al.: "Genetic, enzymatic and structural analyses of phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermococcus kodakaraensis koD1"J.Biochem.. 134. 567-574 (2003)
• [文献書誌] Higashibata, H. et al.: "Helicase and muclease activities of hyperthermophile pyrococcus horikoshii Dna2 inhibited by substrates with RNA segments at 5'-end"J.Biol.Chem.. 278. 15983-15990 (2003)
• [文献書誌] Higashibata H. et al.: "Surface histidine residue of archaeal histone affects DNA compaction and thermostability"FEMS.Microbiol.Lett.. 224. 17-22 (2003)