非プロテアーゼ系炭素-窒素結合切断酵素群の分子機能解析

2004 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 14360047
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用微生物学・応用生物化学
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 小林 達彦 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 教授 (70221976)
• 研究分担者: 橋本 義輝 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 助手 (00323254) ; 東端 啓貴 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 助手 (20344864) ; 間世田 英明 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 助手 (10372343)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2004
• キーワード: ニトリラーゼ / ニトリルヒドラターゼ / アミダーゼ / イソニトリルヒドラターゼ / N-置換ホルムアミド分解酵素 / ニトリル / イソニトリル / N-置換ホルムアミド

研究概要

非プロテアーゼ系炭素-窒素結合切断酵素群の中で、(他の酵素に関しては継続して研究を進めているが)現在、特にイソニトリル代謝に関与する2つの酵素(イソニトリルヒドラターゼ、N-置換ホルムアミド分解酵素)に関して得られている成果を以下に記載する。
イソニトリルヒドラターゼの構造遺伝子(inhA)を単離し、相同性検索にかけた結果、アーキア由来の細胞内プロテアーゼと低いながらも相同性があることを発見した。このプロテアーゼの活性中心アミノ酸残基に相当するイソニトリルヒドラターゼのアミノ酸残基4カ所に対して部位特異的変異法によりアミノ酸置換を行い、変異酵素を精製し、諸性質を解析した。その結果、101番目のシステイン残基をイソニトリルヒドラターゼ反応の活性中心アミノ酸残基であると同定した。
イソニトリル代謝において、イソニトリル分解菌はイソニトリルヒドラターゼによりN-置換ホルムアミドに変換し、さらに分解すると考えられるがそれに関与する酵素は未知であった。自然界より新たにN-置換ホルムアミド分解菌F164株(細菌Arthrobacter pascensと同定)を分離し、本株からN-置換ホルムアミド分解酵素を初めて発見した。本酵素は、N-置換ホルムアミドをアミンとギ酸に変換することから、N-置換ホルムアミドデフォルミラーゼと命名した。本酵素単離精製することに成功し、基質特異性・最適pH・最適温度などN-置換ホルムアミドデフォルミラーゼの生化学的諸性質を解析した。また、本酵素の構造遺伝子の単離にも成功した。相同性検索の結果、全長にわたって有意な相同性を示す既知の酵素は見つからず、本酵素が全く新規であることが示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] High-level expression of a novel amine-synthesizing enzyme, N-substituted formamide deformylase, in Streptomyces with a strong protein expression system (2005)
  • 著者名/発表者名: Fukatsu, H., et al.
  • 雑誌名: Protein Expr.Purif. 40 ページ: 212-219
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Optimum culture conditions for the production of N-substituted formamide deformylase by Arthrobacter pascens F164 (2005)
  • 著者名/発表者名: Fukatsu, H., et al.
  • 雑誌名: Biosci.Biotech.Biochem. 69 ページ: 228-230
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Optimum culture conditions for the production of N-substituted formamide deformylase by Arthrobacter pascens F164 (2005)
  • 著者名/発表者名: Fukatsu, H., Goda, M., Hashimoto, Y., Higashibata, H., Kobayashi, M.
  • 雑誌名: Biosci.Biotech.Biochem. 69 ページ: 228-230
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] High-level expression of a novel amine-synthesizing enzyme, N-substituted formamide deformylase, in Streptomyces with a strong protein expression system (2005)
  • 著者名/発表者名: Fukatsu, H., Herai, S., Hashimoto, Y., Maseda, H., Higashibata, H., Kobayashi, M.
  • 雑誌名: Protein Expr.Purif. 40 ページ: 212-219
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Amine-synthesizing enzyme N-substituted formamide deformylase : Screening, purification, characterization and gene cloning (2004)
  • 著者名/発表者名: Fukatsu, H., et al.
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101 ページ: 13726-13731
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Identification of crucial histidines involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis by aldoxime dehydratase (2004)
  • 著者名/発表者名: Konishi, K., et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 47619-47625
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Heme environment in aldoxime dehydratase involved in carbon- nitrogen triple bond synthesis (2004)
  • 著者名/発表者名: Oinuma, K-I., et al.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 568 ページ: 44-48
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Rhodococcus工業生産菌のニトリル分解酵素遺伝子群の解析と応用 (2004)
  • 著者名/発表者名: 橋本義輝 ら
  • 雑誌名: 日本農芸化学会誌 78 ページ: 1073-1075
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Identification of crucial histidines involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis by aldoxime dehydratase (2004)
  • 著者名/発表者名: Konishi, K., Ishida, K., Oinuma, K-I., Ohta, T., Hashimoto, Y., Higashibata, H., Kitagawa, T., Kobayashi, M.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 47619-47625
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Amine-synthesizing enzyme N-substituted formamide deformylase : Screening, purification, characterization and gene cloning (2004)
  • 著者名/発表者名: Fukatsu, H., Hashimoto, Y., Goda, M., Higashibata, H., Kobayashi, M.
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101 ページ: 13726-13731
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Novel aldoxime dehydratase involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis of Pseudomonas chlororaphis B23 : Sequencing, gene expression, purification and characterization (2003)
  • 著者名/発表者名: Oinuma, K-I., et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem., 278 ページ: 29600-29608
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 新規酵素イソニトリルヒドラターゼの発見 (2003)
  • 著者名/発表者名: 合田昌彦 ら
  • 雑誌名: バイオサイエンスとインダストリー 61 ページ: 469-472
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Novel aldoxime dehydratase involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis of Pseudomonas chlororaphis B23 : Sequencing, gene expression, purification and characterization (2003)
  • 著者名/発表者名: Oinuma, K-I., Hashimoto, Y., Konishi, K., Goda, M., Noguchi, T., Higashibata, H., Kobayashi, M.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 278 ページ: 29600-29608
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A novel lipase from Pseudomonas fluorescens HU380 : Gene cloning, overproduction, renaturation-activation, two-step purification and characterization (2003)
  • 著者名/発表者名: Kojima, Y., Kobayashi, M., Shimizu, S.
  • 雑誌名: J.Biosci.Bioeng. 96 ページ: 242-249
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Site-directed mutagenesis for cysteine residues of cobalt-containing nitrile hydratase (2002)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto, Y., et al.
  • 雑誌名: J.Inorg.Biochem. 91 ページ: 70-77
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Isonitrile hydratase from Pseudomonas putida N19-2 : Cloning, sequencing, gene expression, and identification of its active amino acid residue (2002)
  • 著者名/発表者名: Goda, M., et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 277 ページ: 45860-45865
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Isonitrile hydratase from Pseudomonas putida N19-2 : Cloning, sequencing, gene expression, and identification of its active amino acid residue (2002)
  • 著者名/発表者名: Goda, M., Hashimoto, Y., Takase M., Herai, S., Iwahara, Y., Higashibata, H., Kobayashi, M.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 277 ページ: 45860-45865
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Site-directed mutagenesis for cysteine residues of cobalt-containing nitrile hydratase (2002)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto, Y., Sasaki, S., Herai.S., Oinuma, K,.Shimizu, S., Kobayashi, M.
  • 雑誌名: J.Inorg.Biochem. 91 ページ: 70-77
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より