| 研究課題/領域番号 |
14360053
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
植田 和光 京都大学, 農学研究科, 教授 (10151789)
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| 研究分担者 |
松尾 道憲 京都大学, 農学研究科, 助手 (00335308)
木岡 紀幸 京都大学, 農学研究科, 助教授 (90234179)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| キーワード | コレステロール / トランスポーター / ABCタンパク質 / 動脈硬化 / 3次元構造解析 / 高脂血症 / ABCA1 / 糖尿病 |
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| 研究概要 |
本研究は、ABCA1の機能および分子メカニズムを明らかにするとともに、細胞内局在、動態を細胞生物学に明らかにし、最終的には3次元構造を明らかにするために全長ABCA1を結晶化することを目的としておこなった。
まずABCA1の大量発現、精製系を確立した。ABCA1のC末端にThrombin切断部位とヒスチジンタグを融合したタンパク質をバキュロウイルスベクターに組み込み、Sf9細胞に感染させた。発現量は、感染開始後48時間から72時間で最大となり、全膜タンパク質の約1%程度であった。膜画分を0.8%(w/v)のドデシルマルトシドによって可溶化し、可溶性画分からNi-NTAアガロースによって精製した。Ni-NTAアガロースを用いた精製では、純度は50%程度であった、そこで限外濾過法を用いて濃縮後に陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製を行った結果、最終的にABCA1を約90%の純度で精製できた。
ABCA1は蛋白質として発現後、厳密な翻訳後調節を受けている。そこでその分子メカニズムを明らかにするため、ABCA1のC末端120アミノ酸を用いて酵母Two-hybrid法によりABCA1と相互作用するタンパク質をスクリーニングした。その結果、PDZタンパク質であるα1-syntrophinとLin-7が、ABCA1と相互作用することを見出した。まずマウス脳を用い、抗αl-syntrophin抗体を用いた免疫沈降実験によりα1-syntrophinとABCA1がin vivoで相互作用していることが明らかになった。さらに、培養細胞を用いた実験から、α1-syntrophinはABCA1のC末端の数アミノ酸と強固に結合すること、共発現はABCA1の分解を抑制し、ABCA1の半減期を約5倍長くすることが分かった。α1-syntrophinは特異的にABCA1の分解を抑制していると考えられる。
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