ラクトン環開裂酵素の機能開発と有用化合物生産への応用

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14360054
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 片岡 道彦 京都大学, 農学研究科, 助教授 (90252494)
• 研究分担者: 坂本 恵司 第一ファインケミカル(株), 研究部, 基盤技術開発担当部長(研究職) ; 小川 順 京都大学, 農学研究科, 助手 (70281102) ; 清水 昌 京都大学, 農学研究科, 教授 (70093250)
• キーワード: ラクトナーゼ / ラクトン / Fusarium oxysporum / Agrobacterium tumefaciens / 光学分割

研究概要

ラクトン化合物は自然界に広く存在する化合物であるが、その生合成・代謝に関する研究は多くなされていないのが現状であった。特に、ラクトン化合物の代謝酵素のひとつと考えられるラクトン環開裂酵素(ラクトナーゼ)に関する研究例は非常に少ない。そこで、本研究では、我々がすでに見出しているラクトナーゼに関して、タンパク質化学的手法、遺伝子工学的手法、X線結晶解析法等を用いて、その反応機構、基質認識機構、立体高次構造に関する解析を行い、有用化合物の生産プロセスに応用可能な生体触媒としての機能開発を進めていった。
糸状菌Fusarium oxysporumの生産するラクトナーゼについて、麹菌Aspergillus oryzaeを用いた大量発現法により、高い活性を示す組換え菌株が得られた。本組換え菌株の菌体をアルギン酸カルシウムで固定化することにより、さらに安定化した触媒を得ることができた。この結果、F. oxysporumの固定化菌体を用いた場合よりも、反応速度を速めてラセミ体パントラクトンの光学分割を行うことが可能となった。さらに、これまで不明であったN末端領域のシグナル配列に関しても、小胞体への輸送シグナル、糖鎖付加シグナルとしての役割があることを明らかにした。
また、Agrobacterium tumefaciensの生産するラクトナーゼについても大腸菌を用いた大量発現に成功しており、これを触媒としたラセミ体パントラクトンの新たな光学分割法も開発した。この場合、F. oxysporumのラクトナーゼを用いた場合とは逆の立体異性体を分解することによるものであり、他のラクトン化合物の光学分割にも応用できるものと期待される。

研究成果

• [文献書誌] K.Honda et al.: "Purification and characterization of a novel esterase promising for the production of useful compounds from Microbacterium sp. 7-1W"FEMS Microbiol.Lett.. 206. 221-227 (2002)
• [文献書誌] K.Honda et al.: "Enzymatic preparation of D-b-acetylisobutyric acid and cetraxate hydrochloride using a stereo-and/orregioselective hydrolase, 3, 4-dihydrocoumarin hydrolase, from Acinetobacter calcoaceticus"Appl.Microbiol.Biotechnol.. 60. 288-292 (2002)
• [文献書誌] K.Honda et al.: "Functional analyses of application of microbial lactonohydrolases"Biotechnol.Bioprocess Eng.. 7. 130-137 (2002)
• [文献書誌] M.Kataoka et al.: "A novel dihydrocoumarin hydrolase from Acinetobacter calcoaceticus : Application to the production of useful compounds"J.Molec.Catal.B : Enzymatic. 19-20. 231-235 (2002)
• [文献書誌] K.Honda et al.: "Role of Acinetobacter calcoaceticus 3,4-dihydrocoumarin hydrolase in oxidative stress defence against peroxoacids"Eur.J.Biochem.. 270. 486-494 (2003)
• [文献書誌] K.Honda et al.: "Biocatalytic deprotection of a cetraxate ester by Microbacterium sp. 7-1W cells"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 66. 192-194 (2003)