| 研究課題/領域番号 |
14370032
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
乾 誠 山口大学, 医学部, 教授 (70223237)
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| 研究分担者 |
高 知愛 山口大学, 医学部, 助手 (70314797)
山田 康枝 山口大学, 医学部, 助手 (00166737)
木村 佳弘 山口大学, 医学部, 講師 (90301308)
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| キーワード | 心筋小胞体 / カルシウム・ポンプ / ホスホランバン / 強心薬 / スクリーニング / 心不全 / 蛋白質間相互作用 / 融合蛋白質 |
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| 研究概要 |
心筋の収縮弛緩は、細胞内カルシウム・イオン(Ca^<2+>)によって制御されている。このCa^<2+>は、細胞内Ca^<2+>貯蔵部位である筋小胞体(SR)のCa^<2+>ポンプ(SERCA)及びCa^<2+>遊離チャネルにより調節されている。本研究は、SERCAとその調節蛋白質であるホスホランバンに作用点を有し心筋弛緩促進能を持った新たな心不全治療薬を研究開発することを目的としている。
本研究代表者らは、ホスホランバンとSERCAの融合蛋白質を用い、両者の結合阻害を指標としたスクリーニング・システムを開発してきた。実際に多数の化合物を評価するに当たってはより高感度のスクリーニング法が望ましいため、本年度はスクリーニング・システムの改良を行った。改良に当たっては、ホスホランバンとSERCAの2つの融合蛋白質を用いて抗GSTで検出するELISA法と蛍光標識したホスホランバン合成ペプチドとSERCA融合蛋白質を用いるFMAT法を検討した。その結果、FMAT法では蛍光ペプチドの非特異的結合が強く評価法としては適当でないことが判明した。一方、ELISA法では、非特異的結合も少なく、感度よく評価できることが分かった。さらに、ホスホランバンに対するモノクロナル抗体A-1が、予備検討での結果と同じくホスホランバンとSERCAの融合蛋白質の結合を特異的に阻害し、スクリーニングに際してのポジティブ・コントロールとして使用できることが明らかとなった。さらに、多数サンプルが評価できるように、これまで使用していた96穴プレートのみならず384穴プレートを使用して検討した結果、両者同様に評価系として使用できることが明らかとなった。以上のごとく、高感度ハイスループットのスクリーニング・システムを構築することに成功した。
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