臓器障害におけるMAPキナーゼの役割と網羅的遺伝子発現解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14370036
• 研究機関: 大阪市立大学
• 研究代表者: 岩尾 洋 大阪市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (00137192)
• 研究分担者: 泉 康雄 大阪市立大学, 大学院・医学研究科, 助手 (10347495) ; 光山 勝慶 大阪市立大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (10195414)
• キーワード: 心肥大 / 遺伝子導入 / 病態モデル / アンジオテンシン

研究概要

本研究では個々の病態に至るAKS、MAPキナーゼやAP-1の役割を明らかにすることにより、臓器障害の分子機構の解明や新しい治療戦略の開発を目指す。本研究では、dominant-negative(DN)MAPキナーゼファミリーの遺伝子導入によりMAPキナーゼが各病態モデルの組織障害・臓器障害に直接関与していること証明し、組織障害・臓器障害を防ぐための標的分子となりうるかを調べた。
(1)in vivo遺伝子導入用ベクターの作成
PCR法を用いてMAPキナーゼ(ERK、JNK、p38)のATP結合部位のリジンをアルギニンに置換することによりdominant-negativeに作用する改変遺伝子を作成した。組み換えアデノウイルス作成は、コスミドベクターに3種類のMAPキナーゼのdominant-negative変異体((1)DN-ERK、(2)DN-JNK、(3)DN-p38)遺伝子を組み込んだ。
(2)病態モデルでのin vivo遺伝子導入実験
1)心疾患モデルへの遺伝子導入:アンジオテンシン投与動物、自然発症高血圧ラットを人工呼吸器管理のもとに開胸し左心室腔内に上述のそれぞれの組み替えアデノウイルス(7X10^9PFU)を投与し上行大動脈遮断(15秒間)により心筋細胞に遺伝子を導入する。心肥大抑制効果の経過観察を行い、心エコーで心機能も経時的に観察する。また、病的心肥大にみられる遺伝子発現、間質の繊維化への効果も明らかにする。心筋梗塞モデルは、マウス、ラットの左冠状動脈を結紮し作成すると同時に、左心室腔内に上述のそれぞれの組み替えアデノウイルスを投与し心筋細胞に遺伝子導入する。心エコーで心肥大、心機能の測定を経時的に行い、梗塞部と非梗塞部の各種遺伝子発現、繊維化を比較する。
2)動脈硬化モデル:血管のバルーン障害により中膜の平滑筋細胞が内膜へ遊走し増殖することにより血管内膜は肥厚する。上述のそれぞれのドミナントネガテイブ変異体を含む組み換えアデノウイルス(1X10^9PFU)を血管壁に導入後、バルーン障害を行い、血管平滑筋細胞の(1)増殖、(2)アポトーシス、(3)遊走、(4)血管内膜肥厚、(5)遺伝子発現および(6)転写因子に対する効果を詳細に検討する。さらに、これらの病態モデルに於いて、DNÅチップによる網羅的、経時的遺伝子発現解析を行う。

研究成果

• [文献書誌] Zhan Y, Kim S, Yasumoto H, Namba M, Miyazaki H, Iwao H: "Effects of Dominant-Negative c-Jun on Platelet-Derived Growth Factor-Induced Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation"Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22. 82-88 (2002)
• [文献書誌] Zhan Y, Kim S, Kawano H, Iwao H: "Enhancement of glomerular platelet-derived growth factor-β-receptor tyrosine pjosporylation in hypertensive rats and its inhibition by calcium channel blocker"Hypertension Research. 25. 295-301 (2002)
• [文献書誌] Kawano H, Kim S, Ohta T, Nakao T, Miyazaki H, Nakatani T, Iwao H: "Differential contribution of three mitogen-activated protein kinases to PDGF-BB-Induced mesangial cell proliferation and gene expression"Journal of the American Society of Nephrology. 14. 584-592 (2003)