脂質キナーゼ/PKB/AFX系およびストレスシグナルにより制御される細胞死

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14370059
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 吉川 潮 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (40150354)
• 研究分担者: 松崎 秀紀 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (80335463) ; 山本 利義 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (00324939)
• キーワード: 細胞増殖因子 / 蛋白質リン酸化酵素 / PKB / 転写因子 / AFX / 細胞死 / ストレス刺激 / リン酸化部位特異的抗体

研究概要

蛋白質リン酸化酵素PKB(別名Akt)はホスファチジルイノシトール3-キナーゼの下流標的として細胞増殖因子のシグナルを伝達することが知られている。また、フォークヘッド転写因子AFXはPKBによる恒常的なリン酸化により核移行が防止されており、脱リン酸化を受けることにより核へ移行し転写反応を介して細胞死を促進すると考えられている。一方、私どもはPKBが熱ショックや過酸化水素処理といった各種ストレス刺激によっても活性化を受けることを明らかにしている。そこで、本研究では様々な細胞刺激によるリン酸化反応を介したAFXの制御について解析を実施した。まず、AFXにはPKBにより認識されると予想される3カ所のセリン/トレオニン残基(Thr32、Ser197、Ser262)が存在することから、これらの部位の点変異体を構築し、green fluorescent proteinとの融合蛋白質として培養細胞に発現し細胞内局在を観察した。その結果、Thr32あるいはSer197をAlaに置換した変異体は細胞増殖因子の存在下でも核内に局在することが示された。また、合成リン酸化ペプチドを抗原としてリン酸化部位特異的抗体を作成し解析に用いたところ、これらの2カ所は細胞内でリン酸化を受けており、ことにSer197は細胞増殖因子の除去により速やかに脱リン酸化を受けることが明かとなった。今後は、AFX高発現細胞株を用いて様々な刺激によるAFXのリン酸化と細胞内局在の制御について検討を行うとともに、従来、熱ショック時にPKBと会合することが報告されている低分子量シャペロン(Hsp27、αB-crystallin)によるPKBの細胞内局在制御とAFXの機能調節について合わせて解析を行なうことを予定している。

研究成果

• [文献書誌] Matsuoka, D.: "Activation of AtMk1, an Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase, in vitro and in vivo : Analysis of active mutants expressed in E.coli and generation of the active form in stress response in seedlings"Plant J.. 29・5. 637-647 (2002)
• [文献書誌] Saito, N.: "The family of protein kinase C and membrane lipid mediators."J. Diabetes Complications. 16・1. 4-8 (2002)
• [文献書誌] Oka, M.: "Dual regulation of phospholipase D1 by protein kinase C α in vivo."Biochem. Biophys. Res. Commun.. 294・5. 1109-1113 (2002)
• [文献書誌] Irie, K.: "Establishment of a binding assay for protein kinase C isozymes using synthetic C1 peptides and development of new medicinal leads with protein kinase C isozyme and C1 domain selectivity."Pharmacol. Ther.. 93・2-3. 271-282 (2002)
• [文献書誌] Kikkawa, U.: "Protein Kinase Cδ. (PKCδ) : activation mechanisms and functions."J. Biochem.. 132.6. 831-839 (2002)
• [文献書誌] Yamamoto, T.: "Tyrosine phosphorylation of protein kinase C."Methods in Molecular Biology, Protein Kinase C Protocols. (in press).
• [文献書誌] Nishizuka, Y: "Historical overview : protein kinase C, phorbol ester and lipid mediators. Handbook of Cellular Signaling"Academic Press (in press).