トリパノソーマにおけるプロスタグランジン生合成系の分子生物学的解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14370087
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 井上 豪 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (20263204)
• 研究分担者: 永宗 喜三郎 大阪大学, 微生物研究所, 助手 (90314418) ; 江口 直美 (財)大阪バイオサイエンス研究所, 分子行動生物学部門, 研究副部長(研究職) (10250086) ; 裏出 良博 (財)大阪バイオサイエンス研究所, 分子行動生物学部門, 研究部長(研究職) (10201360) ; 松村 浩由 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (30324809) ; 金久 展子 大阪大学, 大学院・工学研究科, 講師 (20177538)
• キーワード: トリパノソーマ / リーシュマニア / アフリカ睡眠病 / シャーガス病 / プロスタグランジン / 駆虫剤 / フラビン蛋白質 / X線結晶構造解析

研究概要

本研究では、トリパノソーマ(Trypanosoma brucei、T.cruzi)、リーシュマニア(Leishmania major)などの病原性寄生原虫が持つヒトと薬剤感受性の異なるプロスタグランジン(PG)生合成系の酵素を分子生物学的に同定する。そして、遺伝子ノックアウト原虫の作製により、宿主・寄生虫相関における原虫由来のPGの存在意義を明らかにし、同時に遺伝子組換え型酵素の大量発現系を構築して、寄生原虫のPG生合成系を標的とした新規医薬品の開発の基礎を築くことを目的としている。
本年度は、T.brucei PGF_<2α>合成酵素のX線結晶構造解析およびT.brucei PGF_<2α>合成酵素の酵素学的研究で大きな進展が見られた。これまで大腸菌を用いて発現した遺伝子組換え型のTrypanosoma bruceiプロスタグランジン(PG)F_<2α>合成酵素の結晶化に成功し、研究室系のX線回折システムを用いて2.6Å分解能までのX線回折強度データの収集に成功していたが、結晶化の再現性に問題があったために低温下でのX線回折実験が行えずにいた。T.brucei PGF_<2α>合成酵素の精製方法を改良し、クエン酸を用いた結晶化で再現性よく結晶化することに成功し、第3世代大型放射光実験施設Spring-8において2.1Å分解能と飛躍的に分解能の向上したデータ収集を行うことに成功し、精密構造を得ることに成功した。また、T.bruceiのPGF_<2α>合成酵素の変異体酵素を使った酵素学的研究も併せて行い、本構造を基に検討した結果、アルド・ケト還元酵素に保存されているCatalytic tetradで考えられている反応機構とは異なり、リジン残基を唯一の活性中心アミノ酸として還元反応を触媒することを明らかにした。また、阻害剤リード化合物を1種見出し、阻害剤Tolestatおよび基質フェナンスラキノンとの複合体結晶の作製およびデータ収集を行った。
一方、Leishmania majorのPGF_<2α>合成酵素のcDNAクローニングと大腸菌を用いた遺伝子組換え型酵素の発現と精製を行ない、本酵素がT.bruceiのPGF_<2α>合成酵素と免疫交差性を示し、旧世界リーシュマニア(L.major、L.donovani、L.tropica)には存在するが新世界リーシュマニア(L.mexicanaやL.amazonensis)には存在しないことを見出した。さらに、T.cruziのPGF_<2α>合成酵素の精製とcDNAクローニングおよび大腸菌を用いた遺伝子組換え型酵素の大量精製を行い、T.cruziのPGF_<2α>合成酵素はOld yellow protein遺伝子ファミリーに属するフラビン酵素であり、PGH_2以外にも様々な化合物を基質とし、メナディオンやベータラパコンなどのナフトキノンをセミキノンラジカルに1電子還元してこれらの薬物の殺虫効果を誘発し、ニフルティモックスや4-ニトロキノリン-N-オキシド等の薬物を2電子還元して無毒化することを明らかにした。また、T.bruceiのPGF_<2α>合成酵素遺伝子ノックアウト原虫を作製するために、本遺伝子に対して、ネオマイシンとブラスチシジン耐性遺伝子を用いた相同組換えを行ないヘテロ接合体の作製を終了した。

研究成果

• [文献書誌] Inoue, T.: "The First Determination of the Inhibitor Complex Structure of Human Hematopoietic Prostaglandin D Synthase"J.Biochem.. (in press). (2004)
• [文献書誌] Adachi, H.: "Two-liquid hanging-drop vapor-diffusion technique of protein crystallization"Jpn.J.Appl.Phys.. 43. L79-L81 (2004)
• [文献書誌] Inoue, T.: "Mechanism of metal activation of human hematopoietic prostaglandin D synthase"Nature Structural Biology. 10. 291-296 (2003)
• [文献書誌] Inoue, T.: "ヒト由来プロスタグランジンD合成酵素の金属イオン効果のメカニズム"日本結晶学会誌. 45. 190-195 (2003)
• [文献書誌] Inoue, T.: "The significance of the flexible loop in the azurin (Az-iso2) from the obligate methylotroph Methylomonas sp.strain J."J.Mol.Biology. 333. 117-124 (2003)
• [文献書誌] Irikura, D.: "Cloning, Expression, Crystallization, and Preliminary X-Ray Analysis of Recombinant Mouse Lipocalin-type Prostaglandin D Synthase, a Somnogen-Producing Enzyme"J.Biochem.. 133. 29-32 (2003)
• [文献書誌] Kabututu Z.: "Prostaglandin production from arachidonic acid and evidence for a 9,11-endoperoxide prostaglandin H_2 reductase in Leishmania"Intl.J.Parasitol. 32. 1693-1700 (2003)
• [文献書誌] Yamamoto, T.: "Crystallization and preliminary X-ray analysis of TBP-interacting protein from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis strain KOD1"Acta Cryst.. D59. 372-374 (2003)
• [文献書誌] Adachi, H.: "Laser Irradiated Growth of Protein Crystal"Jpn.J.Appl.Phys.. 42. 798-800 (2003)
• [文献書誌] Adachi, K.: "New practical technique for protein crystallization with floating and stirring methods"Jpn.J.Appl.Phys.. 42. L1161-L1163 (2003)
• [文献書誌] Xieyong, Y.: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of mavicyanin from Cucurbita pepo medullosa"Acta Cryst.. D59. 1474-1476 (2003)
• [文献書誌] F.von Delft: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of mavicyanin from Cucurbita pepo medullosa"Structure. 11. 985-996 (2003)
• [文献書誌] Lazarus, M.: "Immunohistochemical localization of microsomal PGE synthase-1 and cyclooxygenases in male mouse reproductive organs"Endocrinology. 143. 2410-2419 (2002)
• [文献書誌] Szallies, A.: "Trypanosoma brucei causes loss of respiration competence and clonal death in the yeast Saccharomyces cerevisiae"FEBS Letters. 25998. 1-7 (2002)
• [文献書誌] Kubata BK: "A key role for old yellow enzyme in the metabolism of drugs by Trypanosoma cruzi"J Exp Med. 196. 1241-1251 (2002)
• [文献書誌] Okano Y: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of Trypanosoma brucei prostaglandin F2 synthase"J Biochem. 132. 859-861 (2002)
• [文献書誌] Matsumura, H.: "Crystal Structure of C4 Form Maize and Quaternary Complex of E. coli Phosphoenolpyruvate Carboxylases"Structure. 10. 1721-1730 (2002)
• [文献書誌] Okano, Y.: "X-ray structure of Galdieria Rubisco complexed with one sulfate ion per active site"FEBS Letters. 527. 33-36 (2002)
• [文献書誌] Mizohata, E.: "Crystal Structure of Activated Ribulose-1,5-bisphosphate Carboxylase/Oxygenase from Green Alga Chlamydomonas reinhardtii Complexed with 2-Carboxyarabinitol-1,5-bisphosphate globisporus"J.Mol.Biol.. 316. 679-691 (2002)