| 研究課題/領域番号 |
14370309
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
東尾 侃二 埼玉医科大学, 医学部, 助教授 (20337603)
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| 研究分担者 |
後藤 雅行 中外製薬株式会社, 創薬企画推進部, 研究員
島 伸行 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (30337604)
須田 立雄 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (90014034)
友保 昌拓 中外製薬株式会社, 創薬企画推進部, 研究員
小平 邦彦 中外製薬株式会社, 創薬企画推進部, 研究員
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| キーワード | 巨核球 / 血小板 / 胞体突起形成 / proplatelet formation (PPF) / PPFコミットメント因子(PCF) / ヒト線維芽細胞 / セラミック培養 / ユビキチン |
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| 研究概要 |
平成15年度はPCF commitment factor (PCF)の同定に向け、ローラーボトルを用いたセラミック静置培養(高密度培養)によるIMR-90細胞の大量培養、培養液からのPCF精製法の確立およびPCFの構造決定を実施した。
1)セラミックを担体とする静置培養(高密度培養)によるIMR-90細胞の大量培養
PCFは極微量成分であることから、精製法の確立およびPCFの精製のために、約1000LのIMR-90培養液を調製した。
2)ヘパリン吸着画分の透析外液からのPCFの精製法の確立
PCFはヘパリン親和性の低分子因子と推定された(平成14年度)ので、培養液(30L)のヘパリンCL-6Bカラム溶出液を透析膜(<MW8.000)で透析した。透析外液からQ-セファロースFF、ヘパリン-5PWおよび逆相(C18)-HPLCによりPCFを精製した。ヘパリン-5PWカラムからの溶出液には透析内液からのPCF精製(平成14年度)と同様に3つの活性画分(PCF-I,-II,-III)が検出されたが、逆相(C18)-HPLCの精製により1つの活性画分(PSF-III)に収束すること、PCFは透析性の低分子因子であることが確認された。また、PCF-IIIの高度精製には還元下のSDS-PAGEが最も効果的であった。
3)PCFの構造決定による同定
培養液(470L)のヘパリン吸着画分の透析外液から精製したPCFを還元下のSDS-PAGEに負荷したところ、10kDaと6.5〜7kDaの2本のバンドが検出されたが、ゲル抽出液のPCF活性は後者のバンドと一致した。後者のバンドをin-gel digestionしアミノ酸配列を決定したところ、PCFはヒトユビキチンと同定された。市販のウシユビキチンおよびリコンビナントヒトユビキチンにもPCF活性が検出され、その活性はトリプシン消化により消失した。分泌タンパク質でないユビキチンの由来はIMR-90細胞の高密度培養による死滅細胞からの漏出によるものと考えられる。細胞内蛋白質がどのようにして細胞外から巨核球(MKs)に作用しPPFを促進するのか、その作用メカニズムおよび生理的意義については現在のところ不明であり今後の課題である。また、長時間を要する大量精製中における細菌の汚染、細菌由来のプロテアーゼによる限定分解を避けるために、0.05%のアジ化ナトリウム存在下で精製を実施した。このことが平成14年度で推定されたPCFの分子量(約3,500前後)との差異が生じた原因と推定される。
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