| 研究課題/領域番号 |
14370309
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
血液内科学
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
東尾 侃二 埼玉医科大学, 医学部, 助教授 (20337603)
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| 研究分担者 |
後藤 雅昭 中外製薬株式会社, 創薬企画推進部, 研究員
島 伸行 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (30337604)
須田 立雄 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (90014034)
友保 昌拓 中外製薬株式会社, 創薬企画推進部, 研究員
小平 邦彦 中外製薬株式会社, 創薬企画推進部, 研究員
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| キーワード | 巨核球 / 血小板 / 胞体突起形成(prpplatelet formation, PPF) / トロンボポエチン(TPO) / PPFコミットメント因子(PCF) / ヒト線維芽細胞 / セラミック培養 / ユビキチン |
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| 研究概要 |
巨核細胞(MKs)を血小板放出に必須である胞体突起形成(PPF)を有するMKs(MKs PPF)に運命づける因子(PPF commitment factor, PCF)の存在を想定し、PCFの探索、精製および同定を行った。
1)PCFアッセイ系の構築と探索:UT-7/TPO細胞をTPOと被検物質存在下で48時間培養し(第一段階)、その細胞懸濁液10μLを10%ヒト血漿、10ng/mlTPOを含むDMEM 100μLに加え、タイプIコラーゲンコートした96-well platesで2時間培養後、MKs PPFを計数する(第二段階)アッセイ系を構築した。ヒト胎児肺線維芽細胞IMR-90培養液のヘパリンクロマトバンクにPCF活性の存在を見出した。
2)PCFの精製:無血清培養液および血清培養液(5%CS)のヘパリンカラムの吸着画分に見出された3つのPCF活性画分(PCF-I, II, III)は、精製が進むにつれて1つの因子(PCF-III)に収束した。PCF-IIIはタンパク分解酵素に感受性の低分子因子で、比活性は極めて高いものの低い希釈率(高濃度)では活性を発現しないのが特徴であった。PCF-IIIは微量因子であるが、ヘパリンカラム吸着画分の透析外液(<MW.8,000)から効率的に精製できることがわかった。
3)PCF-IIIの同定:アジ化ナトリウム存在下で血清培養液470Lのヘパリンカラム吸着画分の透析外液からPCF-IIIを精製した。還元下でのSDS-PAGEでPCF-IIIに相当する活性バンド(6.5〜7kDa)をin-gel digestionし、遊離したペプチドのアミノ酸配列を決定した。PCF-IIIはhuman ubiquitinと同定された。市販のbovine ubiquitinおよびr human His-ubiquitinにもPCF活性が認められ、トリプシン消化により活性は完全に消失した。細胞内タンパク質であるubiquitinが細胞外からMKsに作用し、MKs PPFを促進するメカニズム、その生理的意義については現在のところ不明であり、今後の大きな課題である。
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