脳の発達・機能に及ぼす甲状腺ホルモン作用の分子機構の解明

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14370324
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 村田 善晴 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (80174308)
• 研究分担者: 妹尾 久雄 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (40135380) ; 高岸 芳子 名古屋大学, 環境医学研究所, 助手 (50024659) ; 加納 安彦 名古屋大学, 環境医学研究所, 助手 (50252292) ; 鍋島 俊隆 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 教授 (70076751)
• キーワード: 甲状腺ホルモン / ZAKI-4 / ノックアウトマウス / カルシニューリン / 相同組換え / 免疫組織化学 / 脳

研究概要

我々がZAKI-4と命名した遺伝子は、甲状腺ホルモン応答性遺伝子として同定されたものである。最近、ZAKI-4遺伝子がコードする蛋白、すなわちZAKI-4蛋白が脳の発達や機能に重要な役割を果たしているカルシニューリンの活性を阻害することがin vitroで示された。そこで本研究では、ZAKI-4遺伝子のノックアウトマウスを作製し、生体におけるZAKI-4蛋白の機能を明らかにするとともに、脳の発達・機能に及ぼす甲状腺ホルモン作用機序を解明することを目的とした。
平成14年度では以下のような成果が得られた。
1.ZAKI-4遺伝子ノックアウトマウスの作製
ZAKI-4遺伝子からは選択的スプライシングによりαとβの二つのアイソフォームが産生される。このうち、ZAKI-4βは、中枢神経系のみならず心臓にも強く発現している。そこで、ZAKI-4βをノックアウトすべくターゲティングベクターを構築し、C57BL/6J由来のES細胞であるTT2細胞に導入した。そして、相同組換えによりZAKI-4遺伝子の一部がターゲット遺伝子に置換されたTT2細胞のコロニーを得た。次に、この相同組換えが起こったTT2細胞をICRマウスの8細胞期に注入し、ICRの偽妊娠マウスに移植した。その結果、キメラ率の非常に高い雄キメラマウス数匹を得ることができた。現在、この雄キメラマウスを雌C57BL/6Jマウスと交配しているところである。F1においてアレルの伝達が確認できれば、これらを交配することによりZAKI-4遺伝子のノックアウトマウスが得られると考えられる。
2.ZAKI-4蛋白の脳内分布(カルシニューリンの分布との比較)
我々は、ZAKI-4αおよびβ蛋白をともに認識する抗体の作製に成功した。この抗体は、ヒト胎児腎細胞由来の293細胞株で強制発現させたZAKI-4αおよびβを認識し、マウス組織のウエスタンブロットにおいてもZAKI-4 mRNAの高い発現が認められる脳や心臓でZAKI-4蛋白を示すバンドを描出させることができる。この抗体を用いて、脳におけるZAKI-4蛋白の分布を検討すると、カルシニューリンが強く発現している海馬、大脳皮質、小脳で特に豊富に存在していることが明らかとなった。ZAKI-4蛋白は、ニューロンで発現しており、グリア細胞では検出できなかった。また、ニューロンではZAKI-4蛋白は主に核の周辺の細胞質に局在しており、核内の分布は確認できなかった。また、樹状突起にもわずかではあるが存在することが示された。

研究成果

• [文献書誌] Y.Kanou, N.Abe, J.Ishida, A.Fukamizu, H.Seo, Y.Murata: "Homologous recombination of mouse ZAKI-4 gene to disrupt its expression"Environmental Medicine. 46. 55-57 (2002)
• [文献書誌] Y.Takeuchi, Y.Murata, B.W.O'Malley, S.Refetoff, et al.: "Steroid receptor coactivator-1 deficiency causes variable alterations in the modulation of T3-regulated transcription of genes in vivo"Endocrinology. 143. 1346-1352 (2002)
• [文献書誌] M.Rogattcheva, Y.Hayashi, S.Oda, Y.Murata, et al.: "Type 1 iodothyronine deiodinase in the house musk shrew (Suncus Murinus, Insectivora : Soricidae): Cloning and characterization of complementary DNA unique tissue distribution and regulation by T3"General and Comparative Endocrinology. 127. 48-58 (2002)
• [文献書誌] S.Sakano, Y.Hasegawa, Y.Murata et al.: "Inhibitory effect of bFGF on endochondral heterotopic ossification"Biochem. Biophys. Res. Comm.. 293. 680-685 (2002)