| 研究課題/領域番号 |
14370400
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
田林 晄一 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (90142942)
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| 研究分担者 |
遠藤 雅人 東北大学, 医学部附属病院, 講師 (90282128)
井口 篤志 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (90222851)
宮崎 純一 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (10200156)
新田 能郎 東北大学, 医学部附属病院, 医員
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| キーワード | ORP150 / 脊髄保護 / spinal code injury / 遺伝子導入 / lipofection / naked DNA / adenoviral vector / eNOS |
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| 研究概要 |
本研究は、eNOS及びORP150の発現プラスミドをそれぞれ作製し、naked DNA法およびリポフェクション法を用いた遺伝子導入法により、脊髄動脈内皮細胞にeNOS遺伝子を導入発現させ、脊髄動脈の血行改善を図り、かつ好中球の浸潤を抑えることで虚血再潅流障害を抑え、また脊髄神経細胞にORP150を発現させることで、耐虚血性を高め、対麻痺発生頻度を低下し得るか、明らかにすることを目的としている。
本年度の実績
導入遺伝子の作製
eNOS及びORP150のcDNAを採取する目的で、虚血ストレスを加えたラットの脳からmRNAを採取し、RT-PCR法により、ORP150 cDNAの合成に成功した。eNOS cDNAも同様に、RT-PCR法による採取を試みたが、PCR伸長が得られず、プライマーを数種類作製したがやはり伸長しなかった。このORP150 cDNAを発現プラスミドに組み込み、ORPl50発現プラスミドを作製した。この組み込まれたORP150の下流にEGFP遺伝子を組み込み、このプラスミドが細胞内で発現した際に、蛍光顕微鏡で発現効率を確認できるよう工夫した。このORP150発現プラスミドをリポフェクション法で培養細胞に導入し、in vitroでの発現を確認した。
さらにORP150 cDNAを組み込んだアデノウィルスを作製した。このORP150発現アデノウィルスを培養細胞に感染させ、蛍光発色を確認した。
ウサギ脊髄遺伝子導入モデルの作製
全身麻酔下のウサギを用いて、リポーター遺伝子発現プラスミドをリポフェクション法にて導入した。2日後、ウサギ脊髄標本を採取し、種々の至適条件の設定をおこなった。
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