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平成14年度では、軟骨欠損部における軟骨分化促進のために、軟骨前駆細胞株であるATDC5へのヒアルロン酸合成酵素(以下HAS2)遺伝子導入と軟骨分化能の解析を行った。すなわち、ATDC細胞は培養上清中にインスリンを添加することにより軟骨細胞へ分化し、II型コラーゲン優位の細胞外基質を産生した。
本年度は引き続き、このATDC細胞にレトロウィルスベクターを用いてHAS2遺伝子を導入し、安定したトランスフェクタントを作製した。これらの細胞について、HAS2合成量、ヒアルロン酸合成量、ならびにII型コラーゲン合成量を測定することにより、軟骨分化促進に至適なHAS2導入条件を決定した。さらに、臨床応用にあたっての課題である長期的に安全でかつ安定した軟骨組織修復が得られる方法を確立するため、間葉系幹細胞移植を行うことにより硝子軟骨への分化の促進をめざした。純系ウサギ腸骨より採取した骨髄組織より軟骨分化能を有する接着性の間葉系幹細胞を分離培養し、前述した導入条件にて、レトロウィルスベクターに組み込んだHAS2遺伝子を導入し、コラーゲンゲルに包埋して培養することに成功した。
現在、培養開始後1週、2週、4週、8週の時点で、HAS2合成量、ヒアルロン酸合成量、II型コラーゲンの合成量および免疫染色、トルイジンブルー染色を行い、軟骨分化能について検討している。発現マーカーであるβ-galactosidaseを用い、遺伝子の発現を経時的に観察中である。
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