| 研究課題/領域番号 |
14370468
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| 研究機関 | 大分医科大学 |
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研究代表者 |
吉岡 秀克 大分医科大学, 医学部, 教授 (00222430)
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| 研究分担者 |
調 恒明 大分医科大学, 医学部, 助教授 (50179058)
住吉 秀明 大分医科大学, 医学部, 助手 (60343357)
松尾 哲孝 大分医科大学, 医学部, 助手 (10284788)
二宮 善文 岡山大学, 医学部, 教授 (70126241)
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| キーワード | コラーゲン / 遺伝子発現 / 軟骨 / 細胞外マトリックス / 分子ドメイン |
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| 研究概要 |
1.α1(XI)鎖及びα1(V)鎖コラーゲン遺伝子の転写調節機構の解析
α1(XI)鎖遺伝子のプロモーター領域の種々のDNA断片をルシフェラーゼ遺伝子の上流に繋いだコンストラクトを用いて、その活性を調べたところ、-199〜-65に基本的な活性があることがわかった。この領域をカバーするいくつかのプローブを用いてゲルシフトアッセイを行った。その結果、-147〜-121に結合する因子を認めた。この領域だけを結合したコンストラクトを作製し、ルシフェラーゼアッセイを行い、この領域のみで転写活性があることを確認した。この因子を同定する為に既知の因子のオリゴヌクレオチドを用いて競合アッセイ及び、抗体を用いてスーパーシフトアッセイを行った。その結果、この因子は-136〜-132の逆向きのCCAATを認識するCBF(CCAAT binding factor)であることがわかった。さらに、クロマチン免疫沈降アッセイ法により、in vivoにおいてもこの因子が結合していることがわかった。同様にα1(V)鎖においても、その基本的な活性領域を調べた。その結果、-231〜-80が基本プロモーター領域であることがわかった。この領域をゲルシフトアッセイを用いて、結合するタンパクの存在する領域を解析したところ、三箇所にタンパクが結合していることがわかった。これらのタンパクをオリゴヌクレオチド競合アッセイ法及びスーパーシフトアッセイ法を用いて調べ、上流側よりSp1/Sp3、CBF、Sp1関連因子が結合していることがわかった。その中でCBFが-121〜-117にある逆向きのCCAAT様因子であるCAAATを認識し、この活性に関与していることがわかった。
2.プロα1(XI)鎖Nプロペプチド(Npp)の機能解析
PCR法を用いてcDNAを増幅し、Npp(full length)及びその部分断片を含むGSTフュージョンタンパクを作製した。これらを用いてヘパリンとの結合能についてヘパリンカラムで調べた。その結果、Npp(full length)及びNppのC末1/3をカバーする領域にその結合能があることがわかった。また、可変酸性領域のエクソン6Bでコードされる領域も同様な結合能をもつことがわかった。
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