| 研究課題/領域番号 |
14370471
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
三井 真一 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (20295661)
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| 研究分担者 |
沼尻 敏明 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (20326234)
山口 希 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (40079752)
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| キーワード | セリンプロテアーゼ / ノックアウトマウス / 運動神経 / 脊髄 |
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| 研究概要 |
今年度は、神経系特異的プロテアーゼspinesinとmotopsinについて遺伝子をクローニングし、それぞれのノックアウトマウスの作製を開始した。また、それぞれのプロテアーゼに対する特異抗体の作製を行ない、次年度以降に誕生が予定されているノックアウトマウスの解析に備えた。以下に詳述する。
1)spinesinおよびmotopsin遺伝子のクローニング
Spinesinの第一から第三エクソンおよびmotopsinの第一エクソン近傍のDNAをプローブに129/svマウスゲノムのPACライブラリーを検索した。その結果、spinesinについては1クローン、motopsinについては6クローンの陽性クローンを得ることができた。
2)ノックアウトマウスの作製
Spinesinについては、の膜貫通領域をコードする第二、第三エクソンをpGKneoで置換したターゲティンググベクターを作製した。Motopsinについては、翻訳開始点を含む第一エクソンをpGKneoで置換した。これらのターゲティングベクターをマウスES細胞に導入した後、相同組換えを起こしたクローンをスクリーニングを行なった。およそ200個のES細胞クローンから、spinesinについては1クローン、motopsinについては2クローンの相同組換えクローンを得た。現在、これらのクローンを用いてマウス初期胚に導入してキメラマウスを作製中である。
3)特異抗体の作製
マウスのspinesin, motopsin蛋白質を局在を明らかにするために、特異抗体の作製を試みた。それぞれのプロテアーゼのアミノ酸配列を合成し、ウサギに免役して抗血清を得た。抗血清は、ウェスタンブロット解析では組換え蛋白質を反応性を示した。抗spinesin抗血清は、マウス脊髄前核細胞を染色したが、抗motopsin抗血清はいずれの神経組織とも反応性を示さなかった。
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