| 研究概要 |
マウスの胚性幹細胞に,green fluorescent protein (GFP)遺伝子をもつベクター(pcDNAneo3.1/GFP)をtransfectionさせ,蛍光下で緑色に発色する胚性幹細胞を作成した.そして,この細胞を蝸牛器官培養と共培養させるにあたり,hanging drop法を用いて胚様体を分化させる手技を確立した.蝸牛器官培養は,生後6日のマウスの側頭骨を摘出し,蝸牛骨壁を除去,血管条,らせん靭帯,蝸牛軸などをはずし,コルチ翠を取り出した.組織の摘出は,すべてクリーンベンチの中で,清潔操作で行った.コルチ器は,培養液(DMEM F12)に浸し,37度,5%CO2の環境下で培養を行った.胚様体は,胚性幹細胞をleukemia inhibiting factor (LIF)の非存在下にin vitroで分化させて得られ,3胚葉いずれにも分化する能力を持つ.我々は,蛍光下で緑色に発色する胚性幹細胞を胚様体にまで分化させた.その胚様体を一度トリプシン処理して細胞を分離させた後,蝸牛器官培養の皿へ添加して共培養した.共培養を開始して,1,3,7日目の蝸牛を4%パラホルムアルデヒドを用いて1時間,4度で固定した.そして,その生着部位,およびその分化傾向について,surface preparation法,プラスチック包埋による薄切標本を用い,免疫組織学的検討を行った.胚性幹細胞の分化マーカーとして,Myosin Vllaa, Calbindin, Neurofilament等の抗体を用いた.
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