| 研究概要 |
マウスの胚性幹細胞に,green fluorescent protein(GFP)遺伝子をもつベクター(pcDNAneo3.1/GFP)をtransfectionさせ,蛍光下で緑色に発色する胚性幹細胞を作成した.そして,この細胞を蝸牛器官培養と共培養させるにあたり,hanging drop法を用いて胚様体を分化させる手技を確立した.蝸牛器官培養は,生後6日のマウスの側頭骨を摘出し,蝸牛骨壁を除去,血管条,らせん靭帯,蝸牛軸などをはずし,コルチ器を取り出した.組織の摘出は,すべてクリーンベンチの中で,清潔操作で行った.コルチ器は,培養液(DMEM F12)に浸し,37度,5% CO_2の環境下で培養を行った.胚様体は,胚性幹細胞をleukemia inhibiting factor(LIF)の非存在下にin vitroで分化させて得られ,3胚葉いずれにも分化する能力を持つ.我々は,蛍光下で緑色に発色する胚性幹細胞を胚様体にまで分化させた.胚様体をnestinを用いて免疫染色をすると,胚体外胚葉に相当する部位にnestin陽性細胞を認めた.その胚様体を一度トリプシン処理して細胞を分離させた後,蝸牛器官培養の皿へ添加して共培養した.共培養を開始して3日目の蝸牛を4%パラホルムアルデヒドを用いて1時間,4度で固定した.そして,その生着部位について,surface preparation法,プラスチック包埋による薄切標本を用い検討を行った.移植した細胞は,コルチ器の外側,支持細胞層と思われる場所に生着していることが確認できた.しかし,有毛細胞の列には生着を確認できなかった.
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