歯周病原細菌由来殺細胞因子の細胞障害機構の解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14370601
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 中島 琢磨 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教授 (90256678)
• 研究分担者: 荒川 真一 東京医科歯科大学, 歯学部附属病院, 助手 (20302888) ; 土田 信夫 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (60089951)
• キーワード: Tannerella forsythensis / 歯周病 / 病原因子 / 殺細胞因子 / 遺伝子 / ORF / 組換え蛋白質 / 精製

研究概要

本年度は、Tannerella forsythensis(Bacteroides forsythus)抽出液より分離精製した殺細胞因子の遺伝子の単離・同定と、その組換えタンパク調製法の検討を行い、以下の結果を得た。
1.DEAE-Sepharoseカラム、ゲル濾過、及びHeparinカラムで高度に精製し、SDS-PAGEで分離した殺細胞因子の28.5キロダルトンのタンパクについて、N-末端アミノ酸配列APQNMDVLLを得た。
2.このアミノ酸配列からデジェネラティブ・プライマーを合成し、PCR法にて殺細胞因子の遺伝子断片を得、BLAST検索によって当該因子がprtHプロテアーゼとして報告されていることがわかった。
3.一方、2で調製したDNA断片をプローブとしてλファージベクターで構築したT. forsythusのDNAライブラリーを検索し、報吉されていたPrtHプロテアーゼのDNA配列より長いORFと約2Kbpの5'上流域を持つDNA断片を単離した。
4.prtHプロテアーゼの殺細胞活性や生化学的特性についての具体的な報告はなく、また我々が報告してきたCDT様の活性に関しては全く知られていなかった。また、CDT様因子として報告されている他の因子との構造的な類似性もほとんどないことがわかった。
5.単離したDNA断片から、大腸菌の翻訳開始点の条件に近い(リボソーム結合配列を5'側直近に持つ等)5つのATG,(報告されていたprtHの開始コドンを含み、すべて同一のORFに属する)を選び、それぞれを開始コドンとする遺伝子断片を大腸菌の発現ベクターに挿入してタンパクの発現を試みた。
6.すべての遺伝子断片で、好気条件で培養した大腸菌ではタンパクの検出ができなかったが、大腸菌の抽出液を用いたin vitro発現システム(Roche社、RTS-system)では該当するタンパクの調製が可能であった。しかしRTS-systemで調製したタンパクは全く活性を示さなかった。発現したタンパクの高次構造に間題があると推定して高濃度のDTT存在下で還元処理を行った結果、prtHより上流の開始コドンから翻訳されたタンパクにおいて殺細胞活牲が認められた。
現在、大腸菌でのタンパク発現条件の検討により、定量的な解析に十分な量の殺細胞因子の調製を試みている。

研究成果

• [文献書誌] Gao CF, Ren S, Wang J, Zhang SL, Jin F, Nakajima T, Ikeda M, Tsuchida N.: "P130 and its truncated form mediate p53-induced cell cycle arrest in Rb(-/-) Saos2 cells"Oncogene. 21(49). 7569-7579 (2002)
• [文献書誌] Zhang S, Fukushi M, Hashimoto S, Gao C, Huang L, Fukuyo Y, Nakajima T, Amagasa T, Enomoto S, Koike K, Miura 0, Yamamoto N. Tsuchida N.: "A new ERK2 binding protein, Naf1, attenuates the EGF/ERK2 nuclear signaling"Biochem Biophiys Res Commun. 297(1). 17-23 (2002)