頭頸部癌細胞由来α-N-アセチルガラクトサミニダーゼのクローニングと機能解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14370683
• 研究機関: 松本歯科大学
• 研究代表者: 上松 隆司 松本歯科大学, 大学院・歯学独立研究科, 助教授 (40203476)
• 研究分担者: 高橋 昌宏 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (90340059) ; 田中 仁 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (50267788) ; 古澤 清文 松本歯科大学, 大学院・歯学独立研究科, 教授 (90165481) ; 倉 雄宏 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (00340050)
• キーワード: 頭頸部癌 / マクロファージ活性化因子 / α-N-acetylgalactosaminidase / 免疫抑制

研究概要

本年度は,頭頸部癌細胞に由来するα-NaGalaseの精製を行った.唾液腺癌由来細胞をホモジナイザーで破砕し,12,000×g,4℃で10分間遠心分離して得られた上清を細胞抽出液として実験に供した.培養上清と細胞抽出液中の蛋白を,70%飽和硫酸アンモニウムで沈殿させ,50mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH4.2)に溶解し4℃で透析した.透析した酵素標品にp-nitrophenolで標識した酵素基質を5μmol/mlで添加して反応を開始した.37℃で60分間反応させた後,10%トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させた.放出された.p-nitrophenol量は420nmで分光光度計により測定した.蛋白濃度はBCA法で測定した.透析したHSG抽出蛋白を,0.05Mクエン酸ナトリウム(pH5.0)で平衡化したDEAEカラムに添加し,担体に結合した蛋白をNaClを含む0.05Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で溶出させ,95フラクションに分画した.exo-α-NaGalase活性を示す分画をゲル濾過カラムに添加し,exo-α-NaGahse活性の高い分画を採取し濃縮した.イオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製した唾液腺癌由来α-NaGalaseの分子量は48kDaであった.本酵素は,pH4.2においてexo-α-NaGalase活性とともに,endo-α-NaGalase活性(32.0%),α-galactosidase活性(5.0%)を示した.本酵素をマクロファージ活性化因子に作用させたところ,その生物活性は低下した.現在,本精製蛋白のポリクローナル抗体を作製し,クローニング中である.

研究成果

• [文献書誌] Matsuura T., et al.: "Effect of salivary gland adenocarcinoma cell-derived alpha-N-acetylgalactosaminidase on the bioactivity of macrophage activating factor"International Journal of Oncology. 24・3. 521-528 (2004)
• [文献書誌] Uematsu T., et al.: "Effects of Oral Squamous Cell Carcinoma-derived TGF-β1 on CD26/DPPIV Expression in T Cells"Anticancer Research. 24・2(印刷中). (2004)
• [文献書誌] Shiba T., et al.: "Effect of inorganic polyphosphate on periodontal regeneration"Key Engineering Material. 245・256. 1119-1122 (2004)
• [文献書誌] Uematsu S., et al.: "The orthodontic treatment of an impacted dilacerated maxillary central incisor combined with surgical exposure and apicoectomy"Angle Orthodontist. 74・1. 132-136 (2004)
• [文献書誌] 堂東亮輔: "唾液腺癌細胞における抗癌剤耐性獲得機構 -MDR1,MRP1およびGSTの発現について-"日本口腔組織培養学会誌. 12・1. 27-28 (2003)
• [文献書誌] Uematsu T., et al.: "Expression of ATP-binding cassette transporter in human salivary ducts"Arch.Oral Biol.. 48・1. 87-90 (2003)