| 研究課題/領域番号 |
14370714
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| 研究機関 | 神奈川歯科大学 |
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研究代表者 |
川瀬 俊夫 神奈川歯科大学, 歯学部, 教授 (30084784)
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| 研究分担者 |
根岸 秀幸 神奈川歯科大学, 歯学部, 講師 (60121026)
藤原 努 神奈川歯科大学, 歯学部, 助教授 (50084778)
出口 眞二 神奈川歯科大学, 歯学部, 教授 (60121018)
松澤 光洋 神奈川歯科大学, 歯学部, 助手 (60288082)
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| キーワード | 歯周組織再生 / エナメル基質タンパク質 / 歯根膜由来線維芽細胞 / ラット骨髄由来幹細胞 / 細胞接着因子 / 接着分子の遺伝子発現 / 細胞遊走活性 |
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| 研究概要 |
ヒト歯根膜由来細胞(HPLF)はサンドイッチ法で歯根膜片より遊走した細胞を継代培養して用いた。ラット骨髄由来細胞(RBMC)はラット大腿骨より骨髄を摘出し、培養時に付着性の細胞を用いた。エナメル基質タンパク質(EMD)はエムドゲイン^<【○!R】>を用い、HPLF由来のCASFs(CMP)はconfluent HPLFを無血清のMCDB107で24時間培養した培養上精を脱塩・凍結乾燥した試料を用いた。EMDとCMPは分子足場(molecular scaffold)として疎水性のウエルあるいは培養皿にコーティングしてすべての実験を行った。,細胞接着活性はEMDおよびCMPを1mg/mlに調製し、1/2づつ0.49μg/mlまで希釈し、HPLFあるいはRBMCを播種し、3時間の培養を行い、細胞数はDNA量を測定して解析した。また、EMDおよびCMP20μg/mlを疎水性のウエルにコーティングし、非特異的な反応を除くために熱処理した1mg/mlBSAを添加した。その後、HPLFおよびRBMCを播種し、3時間培養した。その結果、EMDとCMP共にHPLFおよびRBMCに対するCASF活性があった。さらに、HPLFを培養し5nM 1,25 Vitamin D_3あるいは10nM Dexamethasone(Dex)を添加し、分化マーカーのALPase活性を測定した。明らかにCMPコーティングのHPLFが細胞分化が促進されていた。すでに我々は骨タンパク質の一つであるオステオネクチン(ON)はHPLFで産生され、しかもオートクリン的にHPLFで産生され、自己再生に必要なCASF活性が認められた。このONの産生をmRNAの発現をRT-PCRで検討すると、EMDよりCMPで発現が促進していた。CASF活性をもつ接着因子の受容体である接着分子はαとβから成るヘテロダイマーなタンパク分子である。βサブユニットのβ1とβ3のmRNAの発現を調べた。β1mRNAの発現は親水性の培養皿、EMDあるいはCMP、またブランクで十分細胞が接着できない状態でも十分であるが、ほとんどその変化は認められなかった。ところが、細胞が接着するのに必須の条件としてインテグリンの発現でなければならない。細胞の接着強度に関係なくβ1の発現は高かった。ところがβ3の発現は十分接着をしていない細胞ほどその発現量は高かった。接着すべき細胞が、接着できないときにインテグリンの発現が促進するようである。
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