| 研究概要 |
組織再生において組織性幹細胞の役割が注目されている。しかし、歯周組織再生でも歯根膜に歯槽骨骨髄由来細胞の組織性幹細胞の存在が示唆され、本学会でラット骨髄由来細胞(RBMC)がヒト歯根膜由来線維芽細胞(HPLF)の培養上清によって遊走され、その成分に遊走されたRBMCは骨系細胞に分化誘導が促進され骨基質タンパク質のmRNAの発現が認められた。そこで、RBMCがHPLFと直接contactした時にHPLFが受ける影響について検討した。
1)細胞培養:7週齢オスFisher系ラットの大腿骨の骨髄を10%FCSを添加したα-MEMにて培養し、付着細胞を骨髄由来幹細胞をRBMCとし継代1代目の細胞を本実験に用いた。またHPLFはサンドイッチ法によってmigrateした細胞を継代培養し、5%FCSと0.25mM AsA-2Pを添加したD-MEMで培養し、第5代継代細胞を用いた。2)HPLFとRBMCの共培養:HPLFを6x10^4細胞/cm^2密度で播種し、confluentを確認し、RBMCをconfluent HPLFに播種し、5nM D_3,10nM Dexさらに2.5ng/ml bFGFを添加し、増殖活性とALPase活性を測定した。3)ALPase、OPN、Integrin β subunit mRNAのRT-PCRの分析:(1)confluent HPLF上にRBMCを播種し1週間の共培養、(2)confluent HPLFおよび(3)RBMCを1週間培養し、RNAを抽出し、HPLFのALPase、OPN、Integrin β1とβ3 mRNAの発現をRT-PCRで調べた。4)疎水性ディシュにEMDをコーティングし、HPLFを播種、1日の培養後RNAを抽出し、DNAチップで約15,000遺伝子の発現を調べた。
ALPase活性はD_3あるいはDexで促進されるよりもRBMCとHPLFが直接接触することによって、酵素活性は上昇した。HPLFはRBMCと接触することによって、ALPase mRNAの発現が上昇し、さらに骨基質タンパク質であるOPN mRNAの発現の上昇が認められた。さらに細胞接着分子のIntegrin β1 mRNAの発現はRBMCとHPLFの共培養によって促進された。しかし今回のβ3 mRNAの発現はRBMCによってHPLFの発現が抑制された。一方、DNAチップによる遺伝子発現は明らかに発現が上昇していた遺伝子は40個あり、また抑制された遺伝子は3個あった。Cyclin D1,cyclin A2,cyclin-dependent kinase 6,cyclin L2等のcell cycleに関わる遺伝子であった。また、細胞外基質合成に関わる遺伝子の発現が上昇していた。
以上のことから、RBMCが直接HPLFと接触することによってHPLFの分化が誘導されることが明らかとなった。RBMCが骨系の細胞へ分化するばかりでなく、RBMCがHPLFの分化を誘導することが示唆された。
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