DNaseγ遺伝子欠損マウスを用いたアポトーシス機能の解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14370752
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 田沼 靖一 東京理科大学, 薬学部, 教授 (10142449)
• 研究分担者: 塩川 大介 東京理科大学, 薬学部, 助手 (90277278) ; 丸田 英晴 東京理科大学, 薬学部, 助手 (00266917)
• キーワード: アポトーシス / DNaseγ / ノックアウトマウス / ネガティブセレクション / クローナルデリーション / クラススイッチ

研究概要

我々はこれまでにアポトーシスの実行過程の顕著な特徴であるDNAのヌクレオソーム単位での断片化を司るエンドヌクレアーゼを完全精製することに成功し、これをDNaseγと命名した。さらにDNaseγノックアウトマウスの作製に成功し、昨年度の研究成果としてB細胞活性化時のアポトーシスにおけるDNA断片化にはDNaseγが主たる機能を担っていることを明らかとした。しかし胸腺細胞、脾臓B細におけるγ線照射誘導アポトーシスにおけるDNaseγの関与は認められず、DNaseγのアポトーシスへの関与は細胞及び誘導刺激依存的であることが明らかとなった。本年度の研究においては、胎生繊維芽細胞(MEF)のアポトーシスにおけるDNaseγの関与について解析を行った。
MEFにおけるDNaseγ遺伝子発現はCAD、endonuclease Gなど既知のアポトーシスエンドヌクレアーゼと比べ非常に低レベルであり、DNaseγ(-/-)細胞におけるDNA断片化は、TNF-α、アクチノマイシンD、及びエトポシド誘導アポトーシスにおいて野生型細胞と同レベルであった。
DNaseγ遺伝子発現はサイトカイン、分化誘導刺激などにより大きく変動することが知られている。そこで各種サイトカイン刺激を行った細胞をRT-PCR法を用いて解析したところ、IFN-γがMEFにおけるDNaseγ遺伝子発現を強く誘導することを見いだした。
IFN-γ刺激は繊維芽細胞をはじめとする多くの細胞系においてFas感受性を誘導することが知られている。野生型及びDNaseγ(-/-)MEFをIFN-γ存在下に前培養し、抗Fas抗体でアポトーシスを誘導した細胞におけるDNA断片化を解析したところ、野生型MEFで観察されたDNA断片化はDNaseγ(-/-)MEFでは完全に消失していた。さらにTNF-α、アクチノマイシンD、及びエトポシド誘導アポトーシスにおいてもIFN-γ存在下では同様の結果が得られた。
本研究により、MEFアポトーシスにおけるIFN-γ依存的なDNaseγの関与が明らかとなった。またIFN-γ刺激によるCAD、endonuclease Gの発現抑制はMEFにおいて観察されないことから、IFN-γは当該細胞系においてDNaseγ遺伝子発現を誘導することのみならず、CAD、endonuclease Gなどその他のアポトーシスエンドヌクレアーゼの活性化に対し抑制的に働き、総合的にDNaseγ依存性アポトーシ経路へのシフトを誘導していると考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Sei-ichi Tanuma: "Changes in the activities and gene expressions of poly (ADP-ribose) glycohydrolases during differentiation of human promyelocytic leukemia cell line HL-60."Biochimica et Biophysica Acta. 1676. 1-11 (2004)
• [文献書誌] Sei-ichi Tanuma: "Monitoring apoptosis with fluorescent zn^<2+>-indicators."Science, STKE. 223. 17-23 (2004)
• [文献書誌] Sei-ichi Tanuma: "Transcriptional suppression of the HIV promoteer by natural compounds."Antiviral.Res.. 58. 89-98 (2003)
• [文献書誌] Sei-ichi Tanuma: "Sustained release of Smac/DIABLO from mitochondria commits to undergo UVB-induced apoptosis."Apoptosis. 3. 291-299 (2003)
• [文献書誌] Sei-ichi Tanuma: "Subcellular localization of poly(ADP-ribose)glycohydrolase in mammalian cells."Biochem.Biophys.Res.Comun.. 307. 915-921 (2003)
• [文献書誌] Sei-ichi Tanuma: "Putative function of ADAM9, ADAM10, and ADAM17 as APPα-secretase."Biochem.Biophys.Res.Comun.. 301. 231-235 (2003)
• [文献書誌] Sei-ichi Tanuma: "Innate apoptosis of human Blymphoblasts transformed by Epstein-Barr virus : modulation by cellular immortalization and senescence."Cell Struct Funct.. 1. 61-70 (2003)
• [文献書誌] Sei-ichi Tanuma: "Identification of two functional nuclear localization signals in DNase γ and their roles in its apoptoic DNase activity."Biochem.J.. 376. 377-381 (2003)
• [文献書誌] Sei-ichi Tanuma: "Nicotinamide attenuates focal ischemic brain injury in rats : with special reference to changes in nicotinamide and NAD+ levels in ischemic core and penumbra."Neurochem Res.. 8. 1227-1234 (2003)
• [文献書誌] Sei-ichi Tanuma: "Apoptotic DNA endonuclease(DNase-gamma) gene transfer induces cell death accompanying DNA fragmentation in human glioma cells."J Neurooncol.. 63. 25-31 (2003)
• [文献書誌] Sei-ichi Tanuma: "Involvement of DNase gamma in apoptotic DNA fragmentation in histiocytic necrotizing lymphadenitis."Virchows Arch.. 443. 170-174 (2003)
• [文献書誌] 田沼 靖一: "in silico分子設計手法によるアポトーシス制御剤の創製"細胞. 35. 561-563 (2003)
• [文献書誌] 田沼 靖一: "アポトーシス制御とゲノム創薬の展望"細胞. 35. 548-549 (2003)
• [文献書誌] 田沼 靖一: "第2版 分子生物学"丸善(株). 286 (2003)
• [文献書誌] 田沼 靖一: "ゲノム創薬-合理的創薬からテーラーメイド医療実現へ-"化学同人. 199 (2003)