| 研究概要 |
1.トリテルペン生産植物からのトリテルペン合成酵素のクローニング
オタネニンジンからβ-アミリン合成酵素のクローニングの際に用いたプライマーを用いて、PCRにより、他の骨格を形成するトリテルペン合成酵素のクローニングを試みた。その結果、薬用ニンジン毛状根よりダンマレンジオイル合成酵素、カボチャ芽生えよりククルビタジエノール合成酵素、シラカンバ培養細胞よりルペオール合成酵素、セイヨウタンポポよりタラキセロール合成酵素、グレープフルーツより多機能性トリテルペン合成酵素のクローニングに成功した。
2.トリテルペン生産植物からの水酸化酵素、及び、配糖化酵素のクローニング
ソヤサポニンを生産するダイズのESTクローンを利用してトリテルペンの水酸化酵素をクローニングすることにした。まず、機能同定のための発現系の構築を行った。チトクロームP450の発現はこれまで一般に酵母が用いられている。そこで、酵母発現ベクターpYES2と酵母INVSC2株を使用することにした。まず、機能が同定されているケイヒ酸水酸化酵素(Cinnamate 4-hydroxylase, (C4H))を発現させ、発現系を構築することにした。報告されているダイズのC4Hの配列を利用して、ダイズの芽生え由来のRNAから逆転写したcDNAを鋳型にPCRで、ダイズC4HのORFを増幅した。このものをpYES2に組み込み、酵母INVSC2株を形質転換した。形質転換酵母の培養にケイヒ酸を投与し、細胞を収穫した。細胞を酢酸エチルで抽出し生成物をHPLCで調べたところ、生成物としてクマル酸を検出することができた。また、細胞を破砕し、粗酵素面分を調製し、ケイヒ酸を基質にin vitroの酵素活性を調べたところ、クマル酸への変換が確認された。以上の結果から、チトクロームP450型の発現系が構築されたと判断した。
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