| 研究概要 |
本酵素の結晶化の戦略として、可溶性プレニルトランスフェラーゼであるBacillus属のFPP合成酵素を母体として、その触媒部位2箇所FARM, SARMをLePGT-1の相当部位と入れ替えたキメラを作成した。FARMのみ、SARMのみ、及び両方をLePGT-1のアミノ酸配列と置換したコンストラクトを大腸菌にて発現させた。しかしSARM部分をLePGT-1のアミノ酸配列に置換したコンストラクトでは、全くプレニルトランスフェラーゼとしての酵素活性が認められなかった。FARMのみをLePGT-1の相当アミノ酸配列と置換したものに関しては、コントロールに比べ弱いながらもFPP合成酵素活性を示した。このことから、LePGT-1のNDxxD部分がゲラニル基の認識部位であることが示唆された。
一方、大腸菌のオルソログであるUBIAの大量発現を試みた。この酵素も膜結合性であるが、C-末端にアフィニティー精製のHis-tagを連結した発現コンストラクトを大腸菌にて発現させてみた。しかしながら、形質転換体において明確な酵素活性を得るには至らなかった。
並行して、酵母における内在性オルソログCoq2についても同様の検討を行った。Coq2遺伝子を構成的発現プロモータPMA1にて強制発現させたところ、形質転換体で高い酵素活性が認められ、活性を持った蛋白質として大量に発現可能であることが認められた。この発現レベルが、結晶化に足るものであるかは検討中であるが、少なくとも活性ドメインの絞り込みを行うための発現系は構築できた。さらに、この酵素がユビキノン生合成酵素であることから、形質転換酵母のユビキノン量を測定したところ、野生株に比べ、最高で3倍のユビキノンの蓄積を認めた。さらにこの発現コンストラクトを植物用に改変してタバコに導入したところ、同様にユビキノンレベルが2倍にまで上昇することを見出した。
|
