| 研究概要 |
X線結晶構造解析およびクライオ電子顕微鏡と分子生物学的手法を組み合わせ,レオウイルス属に属する分子量7500万の二重殻ウイルスであるイネ萎縮ウイルス(RDV)の全体構造を明らかにするための研究を行った
研究は,主として精製過程でP2タンパク質が欠如した粒子を用いて行い,X線結晶構造解析による3.5Åの電子密度を基に,内殻を構成するP3タンパク質と外殻を構成するP8タンパク質のほぼ完全な原子構造とP7タンパク質の一部の原子構造を明らかにした.さらにこの原子構造から二重殻構造を構成する2種類900個のタンパク質間の相互作用を検討することにより,P3およびP8タンパク質が互いを認識しながら自己会合により二重殻構造を形成する階層的な構造構築機構を提案した.このモデルはP3タンパク質のN末端欠損変異体の作製やRGDV(Rice gall dwarf virus)とのキャプシドタンパク質の交換実験など,様々な生化学的手法により,その妥当性を示した.
RDV粒子内部の構造解析は,クライオ電子顕微鏡法を用いた単粒子解析とX線結晶構造解析を組み合わせて行った.いずれの結果からもウイルス粒子の5回軸付近に転写複合体と考えられる明瞭な分子構造と,粒子内側のRNAの構造を確認することができた.特にX線結晶構造解析の結果と合わせることによりP7タンパク質と考えられる分子領域を特定することができた.RNAの構造に関しては,3層目までは比較的整列した構造を取っており,特に1層目と2層目にdsRNAに相当するロッド上の構造が液晶様構造にパッケージングされている様子が明らかになった.
構造タンパク質の高分解能での構造解析を目指して,RDV粒子からの各構造タンパク質の単離・精製と結晶化を行った他,それぞれの発現系の構築を行い,P2タンパク質の発現系の構築に成功した.
さらにP2タンパク質の粒子上での会合様式を明らかにするための研究を進め,P2タンパク質を保持した状態でのRDV粒子の単離・精製,結晶化に成功した
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