| 研究課題/領域番号 |
14380320
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
船津 高志 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (00190124)
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| 研究分担者 |
田口 英樹 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 助教授 (40272710)
多田隈 尚史 東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (10339707)
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| キーワード | 分子シャペロン / 1分子蛍光イメージング / GroEL |
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| 研究概要 |
シャペロニンGroEL,は、ATP加水分解を伴いながらGroESと結合解離を繰り返し、タンパク質の折れたたみを助けている。我々はGroESとGroELの結合・解離過程を全反射照明による1分子蛍光イメージング法を用いて観察し、シャペロニン反応サイクルが時定数3秒、5秒の2つの律速過程から構成されていることを明らかにした。また、GroELに結合した酸変性GFPは、GroESが結合した後の3秒間は折れたたみが抑制されていることを示した。さらに、ATP加水分解反応を詳細に解析し、時定数5秒の新たなGroEL-GroES-ADP複合体(cisADP^*-complex)の存在を明らかにした。
次に、GroELを構成する2つのリングの両方にGroESが結合した中間状態(Football型複合体)が、反応サイクル中に存在することを確かめるため、高濃度(1μM)の蛍光GroES存在下で、GroESとGroELの結合・解離過程を1分子蛍光イメージングする方法を開発した。このために、ガラス基板に金属薄膜を100nm蒸着し、金属部分に直径約100nmの微小な穴を開けた。このナノ開口にガラス面側からレーザー光を照射すると局所的なエバネッセント場が発生し、溶液中に1μMの蛍光が漂っていても1分子蛍光イメージングすることが可能になった。この手法を用いて、ナノ開口に蛍光標識したGroELを固定し1μM GroES存在下でGroESの結合解離反応を1分子蛍光イメージングした。
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