研究課題
リボソームRNAをコードする遺伝子(rDNA)は細菌からヒトの細胞に至まで多コピーで存在し、真核細胞では反復遺伝子として存在する。通常反復遺伝子ではリピート間での相同組み換えにより、コピー数が徐々に減少していくが、rDNAの場合、コピー数安定化機構が存在し、それにより例えば出芽酵母では約150コピー前後で安定に保持されている。コピー数安定化機構の一つは、組み換えにより減少したコピー数を元に戻す遺伝子増幅作用である。出芽酵母では申請者らが単離したFob1タンパク質(Fob1p)が、このrDNA増幅作用に必須な役割を果たしている。しかし今までの所Fob1pの機能についてはDNA複製阻害反応に必須であること、および核小体に局在すること以外何も判っていない。本研究の最終的な目標はFob1pの生理活性を明らかにし、遺伝子増幅の分子メカニズムを解明することである。本年度は、Fob1pの生理活性として最初に予想されるDNA結合活性を中心に解析した。その締果、1)ChIP法によりFob1pがin vivoでDNA複製阻害点(RFB)に結合していること、2)FOB1遺伝子への変異の導入実験により、Fob1pのZn-fingerモチーフがその結合に必須であること、3)精製したFob1pはゲルシフト法及び原子間力顕微鏡での観察によりによりin vitroでもRFB配列に特異的に結合すること、を見い出した。また、4)DNAフットプリント法による解析で、Fob1pはRFB内の約100bp離れた2ケ所に結合していることが判明した。現在、in vitroのDNA複製系を利用して、Fob1pとRFB配列のみで複製が阻害されるか否かを検討中である。
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