| 研究概要 |
1.カサノリV-ATPaseサブユニットアイソフォームの酵母細胞での発現及び機能解析
a) ade変異を持つ酵母VMA11及びVMA1欠損株の作製:VMA11あるいはVMA1破壊株とade/ura変異株を接合させ、胞子形成、ランダム胞子選抜により目的の三重変異株を作製した。
b) proteolipid subunitアイソフォームのVMA11株での発現及び機能解析:カサノリV-ATPase, protoolipid subunitには6種類のアイソフォーム(VC1-VC6)が存在し、一次構造からは二つのグループに分類される(VC1&3及びVC2,4,5,6)。この二つのグループの代表としてVC3,VC5をVMA11欠損株で発現させ、液胞の酸性化が回復するかどうかを蛍光顕微鏡で観察した。その結果、恒常的に発現する酵母発現ベクターを用いた場合、液胞の酸性化が弱く観察され、その蛍光強度はVC3>VC5であった。更に、機能回復を明確に観察する目的で、誘導可能で大量発現をかけられる酵母発現ベクターに組み込んだVC3,VC5の形質転換体を得た。今後、液胞の酸性化の観察を進めていく。
以上の結果から、VC1,3のグループはVma11pとして機能し、VC2,4,5,6のグループはVma3pとして機能することが示唆された。
II.カサノリV-ATPase, proteolipid subunitアイソフォームに特異的なペプチド抗体の作製
6種類のアイソフォームの一次構造の比較から、N末端領域にそれぞれのアイソフォームを識別できる配列を選択し、オリゴペプチド6種類を委託合成した。現在、ウサギを用いて、それぞれペプチド抗体の作製を進めている。本年5,6月にはすべてのペプチド抗体が得られる予定である。これらの抗体を用いたカサノリ細胞でのアイソフォーム局在性を免疫組織学的に検討していく。
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