| 研究概要 |
本研究では、申請期間内に、シロザより得られる光変換性水溶性クロロフィルタンパク質,CP668の生理学的な機能を分子生物学的手法により解明し、また、その立体構造をX線結晶学的方法により決定する事を目的としている。そのために現在、おおまかに3つの研究プロジェクトを進めている。
1.レポーター遺伝子を用いたシロザCP668の発現特異性の解析
Inverse PCRにより得ているCP668遺伝子のプロモーター領域をGUS遺伝子に接続し、その発現の組織特異性や発生段階の特異性を解析を行っている。現在、コンストラクト作製が終了し、Agrobacterium系を用いてシロイヌナズナへの導入を行っている。
2.CP668の細胞内局在性に関する研究
CP668の細胞内局在性に関与すると考えられるN末端・C末端付加配列の機能を調べるために、この配列をGFP遺伝子に接続し、植物細胞に導入して細胞内局在を解析している。現在、コンストラクト作製が終了し、パ-ティクルガン、およびPEG法により植物細胞へのtransfectionを行っており、結果を解析中である。
3.CP668の組換えタンパク質の安定した発現系の構築
現在、大腸菌中でCP668を発現している発現系は予備実験的なものであり、結晶化を行って立体構造を決定できる程の収量と純度が得られていない。このため、現在発現系の改良を行って、より安定的に大量の純粋な組換タンパク質を得られる発現系を構築している。CP668はS-S結合を多く有していると考えられ、現在は大腸菌で発現させてもほとんどが不活性型として発現される。現在、renaturationの条件改良を試みており、約20%が光変換を回復するような条件を見い出した。今後さらに条件を改良し、結晶化までを行う予定である。
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