超臨界流体中での酵素反応を用いたDNA増幅技術の開発

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14550743
• 研究機関: 福岡大学
• 研究代表者: 三島 健司 福岡大学, 工学部, 助教授 (40190623)
• 研究分担者: 松山 清 福岡大学, 工学部, 助手 (40299540)
• キーワード: PCR反応 / 超臨界二酸化炭素 / 酵素 / 界面活性剤 / 遺伝子 / 生態関連物質

研究概要

既に本研究グループで開発した高圧反応装置を用いて、超臨界二酸化炭素中で生態関連物質であるペプチドを合成することに成功した。さらにこの手法を応用することで、超臨界二酸化炭素中で遺伝子を増幅することに成功した。特に酵素(DNAポリメラーゼ)を界面活性剤で被覆することにより、超臨界二酸化炭素中でも酵素の活性が維持できることがわかった。また、酵素の特異反応に及ぼす反応系内の圧力、組成、温度の影響を調べ、最適な遺伝子増幅条件を検討できた。さらに、本研究で提案した超臨界二酸化炭素法を用いて増幅した遺伝子と通常の水溶液中で増幅した遺伝子の特性を電気泳動測定装置にて検討したところ、超臨界二酸化炭素法を用いて増幅した遺伝子は、通常の水溶液中でのPCR (Polymerase Chain Reaction)法により増幅した遺伝子に比べ、増幅エラーが極めて少ないことがわかった。
さらに、酵素を被覆する界面活性剤の構造が、超臨界二酸化炭素での遺伝子増幅反応の及ぼす影響について、増幅速度の観点から検討した。遺伝子の増幅速度について、高速液体クロマトグラフィーを用いて検討したところ、超臨界二酸化炭素中での遺伝子増幅反応には、AOT等のイオン性界面活性剤に比べ、Span等の非イオン性界面活性剤が有効であることがわかった。また、PCR反応における酵素やプライマー(遺伝子の前駆体)の構造の最適化を検討したところ、従来のPCR反応の問題点であった温度操作を行わずに、遺伝子が増幅可能であることを見出した。

研究成果

• [文献書誌] K.Mishima, K.Matsuyama, M.Baba, M.Chidori: "Enzymatic Dipeptide Synthesis by Surfactant-Coated α-Chymotrypsin Complexes in Supercritical Carbon Dioxide"Biotech. Prog.. (印刷中).
• [文献書誌] K.Matsuyama, K.Mishima, K.Hayashi, H.Matsuyama: "Microencapsulation of TiO_2 Nanoparticles with Polymer by Rapid Expansion of Supercritical Solution"J. Nanoparticle Research. (印刷中).
• [文献書誌] K.Matsuyama, K.Mishima, K.Hayashi, R.Ohdate: "Preparation of Composite Polymer-SiO_2 Particles by Rapid Expansion of Supercritical Solution with a Nonsolvent"J. Chem. Eng. Japan. (印刷中).
• [文献書誌] K.Matsuyama, K.Mishima, K.Takahashi, R.Ohdate, H.Tomokage: "Environmentally Benign Formation of Poly(methacrylate ester)Microspheres by Precipitation Copolymerization in Supercritical Carbon Dioxide"J. Chem. Eng. Japan. (印刷中).
• [文献書誌] K.Takahahi, N.Yamasaki, K.Mishima, K.Matsuyama, H.Tomokage: "Coating of Pulp Fiber with Xonotlite under Hydrothermal Conditions"J. Mater. Sci. Letters. 21. 1521-1523 (2002)
• [文献書誌] K.Mishima, K.Matsuyama, H.Ishikawa, K.Hayashi, S.Maeda: "Measurement and Correlation of Solubilities of Azo Dyes and Anthraquinone in Supercritical Carbon Dioxide"Fluid Phase Equilibria. 194. 895-904 (2002)