| 研究概要 |
メタン生成古細菌の16SrDNAを対象とした変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)法を確立し,水田土壌中のメタン生成古細菌群集を解析することを目的とした。これまで用いられてきた古細菌用のプライマーを基に,水田土壌からの分離菌株およびデータベースに登録されているメタン生成古細菌の16S rDNAの塩基配列との比較を行い,メタン生成古細菌を対象としたPCR-DGGE用のプライマーを5種類(forward2種類,reverse3種類)設計した。これらのプライマーを用いて,13種類の純粋培養菌株から抽出したゲノムDNAについて,PCR増幅およびPCR-DGGEの条件を検討した結果,1組のプライマー対(0357F,0691R)が最適であると考えられた。本プライマー対を用いたPCR-DGGEにより,13種類の純粋培養菌株の16S rDNA断片は,ごく近縁な菌株を除けば,それぞれ異なった位置にバンドが分離し,DGGE解析が可能であることが明らかになった。この方法を用い,メタン生成古細菌を分離した圃場および比較対照の圃場の水田土壌試料より抽出したDNAを対象にDGGEを行ったところ,17本程度のバンドを有する明瞭なパターンが得られた。幾つかのバンドを切り出し,塩基配列を決定したところ,全てメタン生成古細菌由来の16S rDNAであった。以上より,水田土壌中のメタン生成古細菌群集を解析するためのDGGE法を確立することができた。今後は,本方法を用いて,水田土壌中のメタン生成古細菌群集の季節変動圃場間の比較,また,バンドの切り出し・塩基配列決定により群集を構成するメタン生成古細菌の種類の推定を行う予定である。
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