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枯草菌のようなグラム陽性菌の細胞壁は外側からタンパク質の層、テイコ酸の層、ペプチドグリカンの層から構成されている。今回の研究対象であるN-acetylmuramoyl-L-alanine amidase(アミダーゼ)はペプチドグリカンのN-アセチルムラミン酸とL-アラニンの間のアミド結合を加水分解する酵素であり、これらアミダーゼの多くは細胞壁結合ドメインを持っている。本研究では細胞壁結合ドメインの立体構造を明らかにするばかりではなく、ペプチドグリカンへの結合メカニズムや局在性の仕組みの解明することを目的とした。
本年度は特にアミダーゼCwlCの細胞壁結合ドメインの機能を調べるために細胞壁結合ドメインとGSTの融合蛋白質の発現システムの構築をおこなった。蛋白質を精製し、ペプチドグリカンへの結合力を測定した。CwlCの細胞壁結合ドメインは相同性の高い配列が2回繰返している。ペプチドグリカンへの結合は繰返し構造が1回では全く起こらず、繰り返しの順序には関係なく2回繰り返していることが必要であることが分かった。細胞壁への結合に寄与しているアミノ酸残基を特定する実験を現在行った。また、細胞壁結合ドメインのNMR測定をおこなった。分解能の高いスペクトルが得られ、さらに安定同位体標識したサンプルを調製して解析した。繰り返し1回はβαβ構造をとっているが、β-ストランドは繰り返し単位間に形成されていた。繰り返し構造が2回あってはじめて細胞壁への結合能を持つことより、この構造が細胞壁に結合している細胞壁結合ドメインの実体であることが分かった。さらにペプチドグリカン構成ユニットと細胞壁結合ドメインの複合体を解析するため、実験を進めているところである。
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