2002 年度実績報告書

DNA分析手法を応用した甲殻類捕食者によるヒラメ仔稚魚の被食生態の解明

研究課題

研究課題/領域番号	14560160
研究機関	北里大学
研究代表者	朝日田卓北里大学, 水産学部, 講師 (00296427)
研究分担者	山下洋京都大学, 大学院・農学系研究科, 助教授 (60346038)
キーワード	ヒラメ / エビジャコ / ミトコンドリアDNA / 種判別 / 被食 / PCR / 仔稚魚 / イシガレイ
研究概要	今年度は、甲殻類消化管内容物の被食種判別をDNA分析を応用して行なうための手法開発と、宮古湾および仙台湾におけるフィールド調査等を行なった。DNA分析による被食種判別法開発では、ヒラメmtDNAの調節領域周辺について塩基配列を精査し、ヒラメのmtDNAを特異的に増幅するプライマーを数種作成し、増幅試験を行なった。その中でおよそ190塩基の長さのDNA断片を増幅するプライマーセットが、特に被食種判別に有用であることを見出した。評価にあたっては、フィールドで実際に甲殻類に捕食される可能性の高いマハゼ等の魚類、アミ類、多毛類、コエビ類等のDNAを比較対象として用いた。これを受けて、このプライマーセットによるヒラメmtDNAの検出力と甲殻類による消化時間との関係を明らかにするため、エビジャコを捕食者とした飼育実験を行なった。実験は、宮古湾で採集したエビジャコを1週間絶食させた後ヒラメを与え、1.5時間後に残餌を回収した時点を0として、1時間おきにエビジャコの回収を16時間後まで行なった。回収したエビジャコは直ちに冷凍固定し、消化管内容物からのDNA抽出に供した。なお実験時の水温は、ヒラメ仔稚魚着底時期の水温を想定し20℃とした。また大量のフィールドサンプルを分析する際には、迅速かつ正確に処理する手法が不可欠となるため、ELISA法を応用した検出法の開発に着手した。開発中の手法は、PCR産物をナイロンメンブレンに転写後、DNA-DNAハイブリダイゼーションにより検出するもので、DNAの標識にはジゴキシゲニンによる化学標識が有効であり、安全性も高いことを確認した。来年度は検出力の高いプローブの開発などを行い、大量処理法の実用化を図る予定である。さらにヒラメとの比較と広範な応用をめざして、イシガレイmtDNAの調節領域のクローニングを行った。これまでに約1000塩基対の配列を決定し、専用プライマーの開発等を行なっている。フィールド調査は、被食種の消化管内滞留時間とDNAの検出力を考慮して行い、DNAサンプルの調整やヒラメやエビジャコの生息密度など、本調査に向けた知見の整理を行なっている。