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モルモット大脳からクローニングしたIntegrin-linked kinase (ILK)のcDNA (GenBank Accession No. AF256520)をオリゴヌクレオチド変異法により、ILKの触媒ドメインに存在するN末端から359番目のグルタミンサン(E)をリジン(K)に点変異させることで、他の基本ドメインを保存させたまま酵素活性のみを不活化させたドミナントネガティブ体(DN-ILK)を作製した。DN-ILKと野生型ILKは、哺乳類細胞への発現ベクターであるpTracer-CMVベクターに導入した。DN-ILKと野生型ILK cDNAは、神経未分化細胞であるN1E-115細胞に導入後、それらタンパク質を高発現させることによりILKの機能を分化条件と未分化条件の両条件下で評価した。N1E-115細胞には、内在ILKが発現しているのでDN-ILKをステイブル発現することにより内在ILKの活性を阻害した結果、N1E-115細胞の神経突起形成を有意に阻害した。それに対して、野生型ILKをトランジェントに高発現させると、非分化条件下にもかかわらず、N1E-115細胞は神経突起を形成し神経へと分化した。以上の結果から、ILKはN1E-115細胞の神経突起形成に必要不可欠であることがわかった。さらに、ILKのシグナル下流にはp38MAP kinaseが存在し、ILKの活性化後に生じるp38MAP kinaseの活性化がN1E-115細胞の神経突起形成に必要であることを証明した。
また、本研究過程において、DN-ILKをステイブル発現したN1E-115細胞のタウタンパク質は、高リン酸化されることを新たに発見した。この結果は、内在LLKはタウタンパク質が高リン酸化されないように保護していることを示唆している。高リン酸化タウは、アルツハイマー病の病理学的所見で認められる神経原線維変性の発生機構の1つと考えられており大変興味深い。そこで現在、ILKの酵素活性がどのようにタウタンパク質の高リン酸化を阻害するのか、その機構について詳細に検討している。
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